第三章 蛋白质(protein) 第三章 蛋白质(protein) (123－317页 第3，4，5，6，7章) 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 氨基酸 蛋白质概述 蛋白质的共价结构 蛋白质的三维结构 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的性质、分离与纯化 蛋白质? 存在于所有的生物细胞中，主要由20种α－氨基酸按一 定的序列通过肽键缩合而成，具有较稳定的构象，是构 成生物体最基本的结构物质和功能物质。相对分子质量 由数千到数千万。 第一节 氨基酸（amino acid）123页 一、氨基酸—蛋白质的构件分子 二、氨基酸的分类go 三、氨基酸的酸碱化学 四、氨基酸的化学反应 go 五、氨基酸的光学活性和光谱性质 go 六、氨基酸混合物的分析分离 go 结构与三字符 一、氨基酸—蛋白质的构件分子 （一）蛋白质水解 酸水解： 碱水解： 酶水解： 完全水解：混合的氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸 （二）氨基酸的一般结构 （一）蛋白质的水解 水解类型 酸水解 碱水解 酶水解 使用试剂 H2SO4 (4M) 或 HCl (6M), 进行 回流煮沸20h 完 全 水 NaOH (5M)共煮 解 10-20h 蛋白酶 优点 缺点 无消旋作用 色氨酸(P126)被破坏，部 分丝氨酸、苏氨酸水解 (P125) ，天冬酰胺和谷氨 酰胺(P126)脱酰胺基 色氨酸稳定 大多数aa被破坏，有消旋 作用，产物为D-和L-氨基 酸混合物；精氨酸脱氨 无消旋作用，aa 不被破坏 不完全水解，需多种酶协 同作用 （二）氨基酸的一般结构 1.结构通式 H2N COOH Cα R H COO－ 或 ＋ H3 N Cα.
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第三章 蛋白质(protein) 1 第三章 蛋白质(protein) (123－317页 第3，4，5，6，7章) 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 氨基酸 蛋白质概述 蛋白质的共价结构 蛋白质的三维结构 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的性质、分离与纯化 2 蛋白质? 存在于所有的生物细胞中，主要由20种α－氨基酸按一 定的序列通过肽键缩合而成，具有较稳定的构象，是构 成生物体最基本的结构物质和功能物质。相对分子质量 由数千到数千万。 3 第一节 氨基酸（amino acid）123页 一、氨基酸—蛋白质的构件分子 二、氨基酸的分类go 三、氨基酸的酸碱化学 四、氨基酸的化学反应 go 五、氨基酸的光学活性和光谱性质 go 六、氨基酸混合物的分析分离 go 4 结构与三字符 一、氨基酸—蛋白质的构件分子 （一）蛋白质水解 酸水解： 碱水解： 酶水解： 完全水解：混合的氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸 （二）氨基酸的一般结构 5 （一）蛋白质的水解 水解类型 酸水解 碱水解 酶水解 使用试剂 H2SO4 (4M) 或 HCl (6M), 进行 回流煮沸20h 完 全 水 NaOH (5M)共煮 解 10-20h 蛋白酶 优点 缺点 无消旋作用 色氨酸(P126)被破坏，部 分丝氨酸、苏氨酸水解 (P125) ，天冬酰胺和谷氨 酰胺(P126)脱酰胺基 色氨酸稳定 大多数aa被破坏，有消旋 作用，产物为D-和L-氨基 酸混合物；精氨酸脱氨 无消旋作用，aa 不被破坏 不完全水解，需多种酶协 同作用 6 （二）氨基酸的一般结构 1.结构通式 H2N COOH Cα R H COO－ 或 ＋ H3 N Cα H R 7 2. 结构特点 ①除脯氨酸(Pro，P126)为α-亚氨基酸外，与羧基相邻的 α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸。 ②除甘氨酸(Gly，P125) R 是 H外,其它所有氨基酸分子中 的α-碳原子都为不对称碳原子。除甘氨酸外的氨基酸都 具有旋光性。 8 二、氨基酸的分类 (一)常见的蛋白质氨基酸 (20种) (二)不常见的蛋白质氨基酸 (三）非蛋白质氨基酸(150多种) 9 （一）常见的蛋白质氨基酸 N R D E Q K F W Y （一）常见的蛋白质氨基酸 1.按R基团的化学结构分 2.按R基团的酸碱性分 3.根据侧链R基团是否有极性分 4.根据人体能否自身合成 5. 20种氨基酸 11 1.按R基团的化学结构分 ①芳香族氨基酸：3种，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（126 下图） ②杂环氨基酸：2种，组氨酸、脯氨酸（126 中图右） ③脂肪族氨基酸：15种 12 2.按R基团的酸碱性分 ①中性氨基酸:15种 ②酸性氨基酸：2种 ③碱性氨基酸：3种 天冬氨酸、谷氨酸 赖氨酸、组氨酸、精氨酸 13 R 3 根 据 侧 链 基 团 是 否 有 极 性 不带 电荷 6种 极性 氨基酸 带负 电 P 12 7 带正 电 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 酪氨酸 Tyr 谷氨酰氨 Gln 天冬酰氨 Asn 半胱氨酸 P125 甘氨酸 Cys Gly 天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu 组氨酸 His 赖氨酸 Lys 精氨酸 Arg 4.根据人体能否自身合成 ①必需氨基酸（8种）： 甲硫氨酸(Met) 、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys) 、 缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、 色氨酸(Trp)、苏氨酸(Thr) ②半必需氨基酸（2种） ： Arg、His ③非必需氨基酸：其余10种 甘氨酸 丙氨酸 丝氨酸 半胱氨酸 精氨酸 酪氨酸 （干饼丝拌精奶酪） 天冬氨酸 天冬酰胺 谷氨酸 谷氨酰胺 组氨酸 脯氨酸 （天天姑姑祖谱） 15 5. 20种氨基酸 R为C、H基团的氨基酸 R为芳香族基团的氨基酸 R为含硫基团的氨基酸 R为含醇基基团的氨基酸 R为碱性基团的氨基酸 R为酸性基团的氨基酸 R为含酰胺基团的氨基酸 R为C、H基团的氨基酸 ①甘氨酸 ②丙氨酸 ③缬氨酸 ④亮氨酸 ⑤异亮氨酸 ⑥脯氨酸 17 R为C、H基团的氨基酸 ①甘氨酸： ②丙氨酸：（-氨基丙酸） 唯一一个 无旋光性 的氨基酸 18 ③缬氨酸：（-氨基异戊酸） ④亮氨酸：（-氨基异己酸） ⑤异亮氨酸：（-氨基-β-甲基戊酸） 均为必需氨基酸。 ⑥脯氨酸:是一个亚氨基酸。 20 R为芳香族基团的氨基酸 ①苯丙氨酸：（-氨基-β-苯丙酸） ②酪氨酸：（-氨基-β-对羟基苯丙酸） ③色氨酸：（β-吲哚--氨基丙酸） 注：280nm强吸收 21 22 R为含硫基团的氨基酸 ①半胱氨酸：（-氨基-β-巯基丙酸）侧链上含有一 巯基 （-SH），–SH 也是一个高反应性的基团。 ②甲硫氨酸（蛋氨酸） ：（-氨基-γ-甲硫基丁酸）是个疏 水氨基酸。 两个Cys 的巯基 氧化生 成二硫 键 Met在生 物合成中 是一种重 要的甲基 供体 23 R为含羟基基团的氨基酸 ①丝氨酸：（-氨基-β-羟基丁酸） ②苏氨酸：（-氨基-β-羟基丁酸） 在大多 数酶的 活性中 心都发 现有Ser 残基 24 R为碱性基团的氨基酸 ①组氨酸：（-氨基-β-咪唑基丙酸） ②赖氨酸：（, -二氨基己酸）一个双氨基酸。 ③精氨酸：（-氨基-δ-胍基戊酸）是20种氨基酸中碱性最强的氨基酸。 25 R为酸性基团的氨基酸 ①天冬氨酸：（-氨基丁二酸） ②谷氨酸：（-氨基戊二酸） 26 R为含酰胺基团的氨基酸 ①天冬酰胺：（ -氨基-β-羧基丙酰胺） ②谷氨酰胺：（ -氨基-γ-羧基丁酰胺） 27 -C-C-C-N-C-N = Aromatic N+ Trp W Arg R -C- alkaline -OH Tyr Y Lys K -C-C-C-C-NH3+ Amino Acid Subway Map -CN -C-CONH2 -C-C-CONH2 Asn N Gln Q acid amide Asp D Glu E Acid -C-COOH -C-C-COOH -C- -C-C C N N+ His H Central line Gly G Phe F Ala A A Val V Ile I -CH3 C C -C C -C-C-C -H -C-OH Ser S Cys C -C-SH -C-C OH Thr T Met M -C-C-S-C Hydroxy Sulfuric Aliphatic Leu L C -C-C-C C C C HN C-COOH Pro P Imino, Circular 三、氨基酸的酸碱化学 (一) 氨基酸的兼性离子形式 (二) 氨基酸的解离 (三) 氨基酸的等电点 29 (一) 氨基酸的兼性离子形式 氨基酸在中性pH时，氨基和羧基可以离子形式存在。 这样的氨基酸分子含有正、负两种电荷－－兼性离子 COOH H2N Cα H R COO－ 或 α H3N＋ C H R 30 (二) 氨基酸的解离 依照Bronsted-Lowry的酸碱质子理论 A- + H+ HA 氨基酸是一类两性电解质：在水中的偶极离子既起酸 的作用（质子供体），又起碱的作用（质子受体） 酸 的 作 用 COO－ H3 N ＋ Cα H 碱 的 作 用 R 31 解离情况受环境中pH值的影响。 阳离子的 阴离子的 32 解离常数 [A0][H+] Ka1= [A+] Ka1= [H+] pKa1= pH Ka2 [A-][H+] = [A0] Ka2= [H+] pKa2= pH pKa：表示解离基团有一半解离时的pH。 解离常数按酸性递减顺序编号为：pKa1， pKa2、 pKa3等。 解离常数可以通过酸碱滴定来确定P131 (133页表：各氨基酸的解离常数) Handerson-Hasselbalch公式 [质子受体］ pH = pKa + lg [质子供体］ 在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例 氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关。 33 (三) 氨基酸的等电点（isoelectric point,pI） COOH H3N + C R H - COO pK1 H3N H H+ + C R H A0 A＋ - pK2 H COO H2N H+ C H R H A－ 等电点：在某一特定pH值溶液时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净 电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液pH值称为该 氨基酸的等电点。 等电点的计算 中性氨基酸: 酸性氨基酸： 碱性氨基酸： pI = (A + B)/2 pI = (A+ C)/2 pI = (B + C)/2 A－为α-羧基的解离常数；B－为α-氨基的解离常数； C－为侧链可解离基团的解离常数 例题：P133 当溶液pH低于氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之，为负。 应用：根据氨基酸的电荷不同分离混合物。常用电泳方法。 34 四、氨基酸的化学反应 （一）α-氨基参加的反应 （二）α-羧基参加的反应 （三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应 （四）侧链R基参加的反应 35 (一) α- 氨基参加的反应 1.与亚硝酸反应 2.与酰化试剂反应 3.烃基化反应 4.生成西佛碱的反应 5.脱氨基反应 36 1.与亚硝酸反应 标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算 出氨基酸的量 NH2 OH 室温下 R-CH-COOH + HNO2 R-CH-COOH + N2 + H2O 37 2.与酰化试剂反应 与酰氯或酸酐在弱碱 溶液中作用，氨基即被 酰基化。 在多肽和蛋白质人工合成中被用作氨基的保护 试剂。 1 1 5 5 丹磺酰氯 38 酰化试剂 39 3.烃基化反应 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定。 2,4－二硝基氟苯 （DNFB或FDNB，Sanger试剂） 苯异硫氰酸酯 （PITC， Edman试剂） 40 ①与DNFB（FDNB）反应 弱碱 单肽链＋ FDNB 弱碱 DNP－肽链（黄色） 6mol盐酸中 DNP－（N端）氨基酸 ＋ n个氨基酸 乙醚抽提后层析，与标准DNP－ 氨基酸比较，确定N端氨基酸 （DNP-氨基酸）黄色 Frederick Sanger 英国化学家，在生物化学领域的贡献很大，他两次获诺贝尔奖 （1958和1980年）； 42 ②与PITC反应 在弱 碱中 苯氨基硫甲酰衍生物 PTC-氨基酸 苯乙内酰硫脲衍生物 PTH-氨基酸（无色） 43 Edman法测定氨基酸序列 单肽链＋ PITC 弱碱 PTH-氨基酸 + 余下少一个氨基酸的肽链 乙醚抽提后层析，与标准PTH－ 氨基酸比较，确定N端氨基酸 44 4. 生成西佛碱（Schiff's base）的反应 与醛类化合物反应生成弱碱，也就是西佛碱 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间物。 CH2OPO3H2 CH2OPO3H2 H HOOC C H NH2 + O C N － H2O R1 HO ＋ H2O CH3 磷酸吡哆醛 CH2OPO3H2 HOOC H H C N C N R1 CH3 HO Schiff碱 C H 2 O P O 3 H452 ５ 脱氨基反应 氨基酸氧化酶 ５ 脱氨基反应 作业 1. 20种常见蛋白质氨基酸是否都有旋光性？ 2. 带-OH,带-HS、酸性氨基酸和碱性氨基酸各是哪些氨基酸？ 3. pI？氨基酸处在大于自身pI的pH溶液中净电荷为正还是负？ 4. 把一个氨基酸结晶加入到pH7.0的纯水中，得到了pH6.0的溶液， 问此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0？等于6.0？为什么？ 5. 写出组氨酸在pH 1、4、8、12时组氨酸的净电荷是怎样的？ 对每个pH来说，当电泳时，组氨酸是向阳极还是向阴极迁移？ 6. 牢记蛋白质的20种氨基酸的结构特征与三字符缩写 48 (二)α-羧基参加的反应 1 成盐和成酯： 羧基被保护，氨基被活化。 2 成酰氯反应： 氨基被保护，羧基被活化，在多肽人工合成中 常用。 3 叠氮反应： 常用于多肽的合成。 4 脱羧基反应： 49 成酰氯反应 51 脱羧基反应 52 (三)α-氨基和α-羧基共同参加的反应 1.成肽反应 53 2.与茚三酮反应 是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。茚 三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离 氨基的氨基酸都生成紫色化合物（Pro）。 用层析法把各种氨基酸分 开后，利用茚三酮显色可以 定性测定各种氨基酸。释放 的CO2可用于氨基酸定量。 54 氨基酸纸层析 茚三酮指纹熏显柜 55 (四)侧链R基参加的反应 侧链功能团：酚基、胍基、巯基、咪唑基、吲哚基等。 介绍以下的反应： 1.酪氨酸的酚基 2.精氨酸的胍基 3.半胱氨酸的巯基（－SH） 56 1.酪氨酸的酚基 米伦反应（Millon)：酪氨酸与HgNO3、与Hg（NO3)2和HNO3 作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。 Pauly反应：酚基与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 57 2.精氨酸的胍基 坂口反应（Sagakuchi）：胍基与α-萘酚，次溴 酸盐作用生成红色物质。 58 3.Cys侧链上的巯基（－SH） 介绍以下几方面： ①与卤化烷生成稳定的烷基衍生物 pKR=8.33 ②巯基能和各种金属离子形成络合物 ③巯基易受空气或其他氧化剂氧化 ④与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应 ⑤巯基能打开氮丙啶的环 59 ①与卤化烷生成稳定的烷基衍生物 可保护 -SH 以防被氧化。 60 ②巯基能和各种金属离子形成络合物 含-SH的 酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将 导致酶失活。 对羟基汞苯甲酸 对氯汞苯甲酸 61 ③巯基易受空气或其他氧化剂氧化 形成两种氧化衍生物 形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用。go 形成二硫化物：胱氨酸的形成。 go 62 形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用。 HCOOOH 过甲酸 磺酸基 63 形成二硫化物：胱氨酸的形成。 二 硫 键 O2 胱氨酸 64 二硫键的还原（打开）? 常用的打开二硫键的试剂主要有： a氧化剂：过甲酸（HCOOOH） b还原剂：巯基乙醇（HSCH2CH2OH） 、二硫苏糖醇 等。 65 a氧化剂：过甲酸（HCOOOH） 66 b还原剂：巯基乙醇 67 ④与二硫硝基苯甲酸（DTNB）反应 为半胱氨酸定量 硫硝基苯甲酸 pH8.0时，在412nm波长处有强烈 吸收。可用比色法定量测定半胱 氨酸的含量。 ⑤ Cys巯基打开氮丙啶的环 氮丙啶 五、氨基酸的光学活性和光谱性质 (一) 氨基酸的旋光性 甘氨酸无旋光性 苏氨酸、异亮氨酸 L-，D-构型 (二)氨基酸的光谱性质 紫外吸收光谱 三种芳香族氨基酸都吸收紫外光， 在中性pH条件下，色氨酸280nm，酪 氨酸275nm，苯丙氨酸257nm， 溶液中蛋白质在280nm处有最大吸 收峰，用紫外分光光度计可以测定样 品中蛋白质的含量。 核磁共振波谱 六、氨基酸混合物的分析分离 （一）分配层析法的一般原理 （二）分配柱层析 （三）纸层析 （四）离子交换层析 （五）薄层层析 （六）高效液相层析 72 （一）分配层析法的一般原理 固定相(静相) 层析系统 流动相(动相) 分配系数(Kd) = CA CB 固相 液相 半液相 液相 气相 溶质在溶剂 I（动相）中的浓度 溶质在溶剂 II （静相）中的浓度 层析法分离混合物的先决条件： 各种氨基酸成分的分配系数要有差异，差异越大，越容易分开 73 (二) 分配柱层析 填充物： 亲水性的不溶物质，如纤 维素、淀粉、硅胶等。 洗脱剂： 与水不互溶的溶剂，如苯 酚、正丁醇 等。 75 76 (三) 纸层析 滤纸纤维素上吸附的水是固定相，有机溶剂作为流动相 。 原理：是根据混合物中溶质物质的分配系数不同进行分离的。 原点 溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯 赖 相对迁移率 Rf = X/Y 77 纸层析操作 1. 点样 4.分析 3.显色 2.展层 78 (四)离子交换层析 基质:树脂（不溶性的高分子化合物，球形颗粒） 带电基团：通过化学反应引入基质。 种类 –阳离子交换树脂： 带酸性基团（-SO3H、-COOH）、能解离出质子，与溶液中阳离子发生交换 –阴离子交换树脂： 氨基酸与树脂的亲和力： –取决于它们之间的静电吸引 –氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用。 80 81 图示： （五）薄层层析 薄层层析是以均与涂布于玻璃板上的薄层基质 为固定相，以液体为流动相的一种层析技术。 83 （六）高压液相层析 84 作业 1.α-氨基酸的烃基化反应常用的二种试剂？ Edman法测定氨基酸序列原理？ 2.半胱氨酸的巯基都有哪些反应？常用的打开二硫 键的氧化剂和还原剂是什么？ 3.氨基酸分配层析原理？ 4.离子交换层析原理？ 85