Transcript Tipos de Métodos Rápidos - Sr. Claudio Hirai

TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS
MÉTODOS RÁPIDOS
• Os métodos rápidos tomaram impulso na
década de 90 com o impacto dos custos
crescentes com lead time para a liberação dos
produtos para o mercado consumidor.
• Podemos dizer hoje que os métodos rápidos e
a automação fazem parte de uma área
dinâmica da microbiologia aplicada que tem
como áreas principais:
MÉTODOS RÁPIDOS
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O isolamento dos microrganismos.
A detecção precoce.
A identificação dos microrganismos.
A quantificação dos microrganismos.
Métodos rápidos
identificação
MÉTODOS RÁPIDOS
• Métodos rápidos para identificação
microbiana
• Vitek –depende do crescimento bacteriano,
utilização de carbohidratos e substratos
bioquímicos.
• Tempo de incubação 2 a 24 horas
• Capacidade de 30 a 60 amostras por dia
• Biblioteca > 350 especies bacterianas e
leveduras
Métodos rápidos
• Métodos rápidos para identificação
microbiana
• Biolog – depende do crescimento microbiano
e baseia-se na utilização de carbohidratos
• Tempo de incubação – 2 a 72 horas
• Capacidade de 100 amostras por dia
• Biblioteca > 2000 espécies bacterianas e
olores e leveduras
Métodos rápidos
• Métodos rápidos para identificação
microbiana
• Phoenix – depende do crescimento
microbiano , baseia-se na utilização de
substratos bioquímicos e sensibilidade aos
antibióticos
• Tempo de incubação - 3 horas
• Capacidade de 100 amostras por dia
• Biblioteca > 230 espécies bacterianas
Métodos rápidos
• Métodos rápidos para identificação
microbiana
• MIDI – SHERLOCK MIS - baseia-se na
identificação dos ácidos graxos extraídos de
colônias isoladas .
• Tempo de análise de +/- 2 horas
• Capacidade de 100 amostras por dia
• Biblioteca de >1500 espécies bacterias e
fungos e bolores.
Métodos rápidos
• Dupont Qualicon + Riboprinter – ribotipagem
de fragmentos de DNA
• Pathogenetix- marcação fluorescente do DNA
• Capacidade de identificar culturas mistas
• Bilbioteca extensa > 1000 microrganismos
• Outras técnicas –
Espectroscopia Raman
• FT-IR
Métodos rápidos
• MALDI-TOF ( MATRIX-ASSISTED LASER
DESORPTION IONIZATION – TIME OF FLIGHT)
• Baseia-se na análise e detecção de um grande
espectro de proteínas, capaz de discriminar
espécies estreitamente relacionadas. A matriz
utilizar as proteínas foi mudada para que
possibilitasse as proteínas ribossomicas ,
• Neste sistema os microrganismos são colocados
em uma placa que contem uma matriz polimérica
Métodos rápidos
• A placa é irradiada com um laser que vaporiza
a amostra ionizando as moléculas que são
aspiradas e elevadas a um detetor.
• Dependendo da molécula o tempo de
chegada será diferente (time of flight), os
dados obtidos através destas leituras são
comparados a uma base algorítimica que
contém uma biblioteca possibilitando a
identificação de bactérias, leveduras e fungos.
Métodos rápidos para detecção e
contagem de microrganismos
• Bioluminescência – técnica baseada no
princípio da medição da quantidade de
Adenosina trifosfato (ATP).
• E + LH2 +ATP → E-L2-AMP+ PP
• E-LH2-AMP + O2 → oxiluciferina + CO2 +AMP
+LUZ
• E= Enzima luciferase, lh2 = luciferina , E-LH2AMP = COMPLEXO LUCIFERASE-LUCIFERINA AMP
Métodos rápidos para detecção e
contagem de microrganismos
• Equipamentos que utilizam a técnica do ATP CELSIS,HITACHI,LONZA
Métodos rápidos para detecção e
contagem de microrganismos
• GeneDisc –Pall Corp. –princípio – amostras são
filtradas em membrana e lisadas através de
reagentes específicos –adiciona-se polimerase e
desoxinucleotídeos em uma placa própria que
contém os primers e os probes .
• Quando o DNA de interesse é amplificado ,um
sinal fluorescente do probe é detectado e medido
. O equipamento vem com 6 probes que permite
a realização do teste limite USP em até 1 hora.
Métodos rápidos para detecção e
contagem de microrganismos
• IMPEDÂNCIA-CONDUTÂNCIA – baseia-se na
propriedades que os microrganismos têm de
alterar a transmissão da corrente elétrica
através de um meio de cultura.
• Exemplos Rabit, Malthus ,Bactometer
Métodos rápidos para detecção e
contagem de microrganismos
• Outras técnicas disponíveis ´- light scattering,
PCR.
• Testes de esterilidade – inoculação direta em
meio de cultura , medição de CO2
• BACTEC, BACT/ALERT
Métodos rápidos de alta sensibilidade
• Capacidade de detectar 1 célula – bactérias,
leveduras, fungos e esporos.
• Carga microbiana de matérias primas ,
controle em processo, produtos acabados ,
água e testes de esterilidade.
• Vantagens sobre o teste tradicional 14 dias vs
1 a 3 horas
• Para amostras filtráveis.
Métodos rápidos de alta sensibilidade
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Millipore –Milliflex Rapid e Quantum
Sensibilidade -1UFC após o crescimento
Rapid –ATP
Sensibilidade 1 UFC
Tempo de incubação -24 horas
Carga microbiana, matérias primas , produtos
acabados, água e testes de esterilidade.
Métodos rápidos de alta sensibilidade
• Milliflex Quantum
• Sensibilidade 1 UFC
• Quantum –coloração vital , amostra é filtrada
e a membrana é inoculada em meio contendo
substrato fluorescente , que libera o
fluorocromo no citoplasma celular.
• Um leitor permite a quantificação das colonias
e mesmo a identificação dos microrganismos.
Métodos rápidos de alta
sensibilidadee
• AES Chemunex D-Count e BactiFlow
• Sensibilidade 10 a 50 UFC
• Carga microbiana de matérias primas, controle
em processo, produtos acabados e água.
• Coloração vital e citometria de fluxo
Métodos rápidos de alta sensibilidade
• Citometria de fluxo – o sistema marca o ácido
nucléico com um corante fluorescente , sendo
que a amostra é lida em um citometro de fluxo .
• Amostra filtrada em um filtro membrana ,sendo
que o microrganismo retido no filtro é marcado
com um substrato não fluorescente
• O metabolismo microbiano atua
enzimaticamente liberando o fluorocromo,
possibilitando a detecção pelo laser.
Métodos rápidos de alta sensibilidade
• AES Chemunex –ScanRDI
• Sensibilidade 1 UFC
• Carga microbiana de matérias primas, controle
em processo, produtos acabados, água e
testes de esterilidade.
• Tempo 1,5 horas .
• Princípio – coloração vital e citometria de fase
sólida.