Transcript Metode Mikrobiologis-2

Metode Mikrobiologis-2
8. Enumerasi mikrobia
Total counts
 Breed slide method
 Petroff-Houser chamber
 Haemocytometer
Viable count
 Spread-plate technique
 Pour-plate technique
 Filtration
 MPN (Most Probable Number)
Berat kering
Spectrophotometric
Breed’s Slide method
•
•
•
Sejumlah volume (0,1 ml) sampel dibuat preparat smear di atas gelas
benda dengan luas tertentu (1 x 4 cm2)
Difiksasi, lalu diwarnai dan dikeringkan
Diamati di bawah mikroskop cahaya
•
Densitas bakteri (sel/ml) = (As x N)/(Af x V)





N: jumlah rerata sel/bidang pandang (sel)
As: Luas area smear (As = 400 mm2)
Af:: Luas bidang pandang (mm2)
V: volume sampel (ml)
DF: (dilution factor) = faktor pengenceran
•
•
Densitas (sel/ml) = (400 x N x)/(Af ) (x 1/10)
Densitas (sel/ml) = (400 x N x)(10)/(Af )
•
Densitas dalam suspensi (sel/ml) = (400 x N x DF x 10)/(Af )
Total count: Petroff-Hauser Chamber
Haemocytometer
Total count: Haemocytometer
•Luas kotak di tengah (L1) = 1 mm2 (dibagi 25 = 1/25 mm2)
•Kedalaman (d)
= 0,02 mm
•Volume (V1)
= 1mm2 x 0,02 mm = 0,02 mm3
= 0,02 x 10-3 cm3 (1 cm3 = 1000 mm3)
= 2 x 10-5 cm3 (= 2/105 cm3 =2/100.000 cm3)
=1/50.000 cm3
= 1/50.000 ml
Contoh:
Jika jumlah sel dalam kotak (L1) = 28 sel (= 28 per 1/50.000 ml)
= 28 x 50.000 sel/ml
= 1.400.000 sel/ml
Bidang Pandang
• Luas kotak (L2) = 1/25 mm2
• Kedalaman (d) = 0,02 mm
• Volume (V2)
= 1/25mm2 x 0,02 mm
= 8 x 10-4 mm3
= 8 x 10-4 x 10-3 cm3
= 8 x 10-7 cm3
= 8 x 10-7 ml
= 8/107 ml
= 1/ 1.250.000 ml
Contoh:
Jika jumlah sel dalam kotak (L2) = 28 sel (= 28 sel per 1/1.250.000 ml)
= 28 x 1.250.000 sel/ml
= 35.000.000 sel/ml
• Luas kotak (L3) = 1/400 mm2
• Kedalaman (d) = 0,02 mm
• Volume (V3)
= 1/400 mm2 x 0,02 mm
= 5 x 10-5 mm3
= 5 x 10-5 x 10-3 cm3
= 5 x 10-8 cm3
= 5 x 10-8 ml
= 5/108 ml
= 1/ 20.000.000 ml
Contoh:
•Jika jumlah sel dalam 5 kotak (L2) = 500 sel
•Dalam 5 kotak L2 terdapat: 5 x 16 kotak L3 = 80 kotak L3
•Maka Jumlah rerata sel per kotak L3 = 500/80 sel/(1/1.20.000.000 ml)
= 6,25 sel/(1/1.20.000.000 ml)
= 6,25 x 20.000.000 sel/ml
Petroff-Hausser Chamber
Luas kotak terkecil (L) = 1/400 mm2 ;
Kedalaman (d) = 0,200 mm
Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 0,200 mm3
= 1/400 x 2/10 mm3
= (1/400 x 2/10) x 1/1.000 cm3
= (2/4000) x 1/1000 cm3
= 2/4.000.000 cm3
= 1/2.000.000 ml
Haemocytometer
Luas kotak terkecil (L) = 0,025 mm2 ; Kedalaman (d) = 0,1 mm = 1/10 mm
= 1/400 mm2
Volume kotak terkecil (V) = 1/400 x 1/10 mm3
= 1/4.000 mm3
= (1/4.000) x 1/1000 cm3
= 1/4.000.000 cm3
= 1/4.000.000 ml
Haemocytometer
Bidang pandang
Spermatozoa
Viable count
•
•
•
•
Metode Pengenceran sample
Plating pada medium padat dan diinkubasikan
Hitung jumlah koloni
Kerapatan mikrobia/ml sample dapat dihitung:
= jumlah koloni x faktor pengenceran
e.g. jika sampel yang diencerkan 10-6 x
diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke dalam
medium padat. Setelah diinkubasikan ditemukan
sejumlah 50 koloni. Berapakah kerapatan
mikrobia per ml atau gram sampel ?
Plate Count
HPC: Heterotrophic Plate Count
Persayaratan Plate Count
1. Jumlah koloni/petridish 30 – 300, jika tidak ada
yang memenuhi, dipilih ang terdekat
2. Koloni spreader tidak dipakai
3. Perbandingan hasil pengenceran yang
berurutan:
 jika  2 : hasilnya direrata
 jika > 2 : dipakai pengenceran yang lebih kecil
4. Jika ada ulangan maka jumlah koloni direrata
Perhitungan
Pengenceran
10-4
10-5
Jumlah
koloni/Petridish
350
280
25
24
10-4
10-5
300
62
10-4
10-5
250
70
spreader
Kerapatan sel
(cfu/ml)
2.800.000
4.300.000
50
270
80
2.600.000
Membran filter
Kerapatan sel sangat rendah:
•Sejumlah volume sampel difilter
•Filter diletakkan di atas medium
•Dihitung jumlah koloni yang
tumbuh
•Dihitung kerapatan per volume
sampel
N.B. Metode ini digunakan jika kerapatan mikrobia dalam sampel
sangat rendah !
Metode MPN
Sampel diencerkan lalu diinokulasikan ke dalam medium cair
Diinkubasikan lalu di amati adanya pertumbuhan mikrobia
Kerapatan dihitung berdasarkan jumlah sampel yang positif tumbuh
Jumlah tabung positif di antara 5 ulangan masing2 pengenceran
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
5
5
5
4
3
0
0
0
Jika dipilih ; 5 4 3 dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6 maka angka
MPN untuk tiap 100 gram atau ml sampel: 280 x 105/100 ml sampel
Angka 280 diperoleh dari Tabel MPN (Hoskins)
Metode Berat Kering (Biomasa)
• Kultur mikrobia disample dengan volume
tertentu (ml)
• Dikeringkan pada 80°C sampai beratnya
konstan
• Kerapatan dinyatakan dengan mgDCW/ml atau g-DCW/ml
Metode Spektrofotometri
• Kultur cair mikrobia diambil
• Dimasukkan ke dalam kuvet
• Dibaca nilai OD pada panjang gelombang
tertentu, mis OD-600 nm
• OD: Optical Density
9. Karakterisasi dan
Identifikasi
Metode konvensional-tradisional
Metode Kimiawi
Metode Molekular

Identification of microorganisms can be
based on various characters:
› Morphology: rely on morphological
characters
› Physiology and metabolic: obtained by
growing microorganisms on various media
and under various growth condition
› Serology: based on running immunological
reaction
› Genetic
OF TEST
INDOLE TEST
MICROTITER PLATE
Salmonella serological reaction