Transcript az előadás prezentációja formátumban, 240 kB

Dystrophinopathia: út a
genetikai
diagnosztikától a
terápiáig
Endreffy Emőke, László Aranka
SZTE Gyermekklinika, Szeged
Dystrophinopathiak (DMD/BMD)
DMD: XR öröklődésű, lethalis, progresszív izomvesztéssel
járó neuromuscularis genetikai kórkép (1/3 500 fiú, BMD
1/30 000 fiú).
Betegek: 2/3-a deletios, 1/3-a új mutációt hordoz
Gén: Xp21 régió, 2.22Mb, 79 exon, 2 deletios ”forró pont ”
7 szövet specifikus promóter, számos splice variáns (5
izoforma).
mRNS: 11kb. Dystrophin: 3685aa, 427kDa, 4 domain,
subsarcolemmalis fehérje (”lehorgonyzó” szerep,
mechanikai stabilitás).
Expresszió: izomban (váz-, szív-, simaizom) és az agyban.
1g izomban 114 billió dystrophin molekula van!
Geno/fenotípus összefüggések: frameshift hipotézis (92%).
Oki terápia: jelenleg nincs, majd a génterápia lesz.
Molekuláris genetikai vizsgálatok célja: diagnózis
megerősítése, (prognózis?), carrier kimutatás, praenatalis
diagnosztika, újabban: génterápia!
p
Xp21.2
/dystrophin
gén/
q
X kromoszóma
A dystrophinhoz kapcsolódó glikoprotein komplex sematikus ábrája a sarcolemmán
keresztül. A dystroglikan komplex lehorgonyozza a cytoskeletális
mikrofilamentumokat a dystrophinen és lamininen keresztül az extracelluláris
matrixhoz. A sarcoglycan komplex komponenseit más gének kódolják.
Normál
DMD beteg
izomszövet
A dystrophin lokalizációja az
izomszövetben
Molekuláris genetikai vizsgálatok DMD/BMD-ben
19 génszakasz vizsgálata: Pm és 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48,
49, 50, 51, 52, 60 exonok, melyek leggyakrabban szenvednek deletiot.
Deletiós fiúbeteg: 107 (63%), nem deletiós 63 (37%)
Mw
D/ 695
D/566
D/591
STR-45
D/593 D/692
D/569
D/570
D/571
D/572
547bp (e45)
506bp (e48)
459bp (e19)
416bp (e17)
360bp (e 8)
268bp (e 44)
D/569: P. E. (apa)
D/570: G. E (anya)
D/571: P. E. (DMP-s fiú)
D/572: R. E. (leánytestvér)
Családvizsgálat 8 STR markerekkel: 122
Prenatalis diagnosztika: 49, 36 fiúmagzatból: 26 egészséges
(72%), 10 beteg.
13 leánymagzat: carrier vizsgálat mikor (EU előírások!)?
Csapdák: pontos-e a diagnózis? Informatív-e a marker? A család kapott
tájékoztatást a betegség örökletes voltáról? Történt-e gén
rekombináció a családon belül?
Ismeretük a személyre szóló terápiás lehetőségek miatt
fontos!
106 dystrophinopathiás betegünk deletioi
del
00
del
10
del
20
del
30
del
40
del
50
del
60
del
70
106 dystrophinopathiás betegünk exon
deletioinak gyakorisága
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
del 69
del 65
del 61
del 57
del 53
del 49
del 45
del 41
del 37
del 33
del 29
del 25
del 21
del 17
del 13
del 9
del 5
del 1
Egy gyógyszer kipróbálás fázisai:
1.
Pre-klinikai fázis: laboratóriumi vizsgálatokkal,
állatkísérletekkel. Célja: biológiai aktivitás és biztonság,
adagolási forma meghatározása.
2. Klinikai fázis I: 20-100 egészséges felnőtt önkéntesen,
biztonsági elemzés.
3. Klinikai fázis II: 100-500 önként jelentkező betegen, az
optimális dózis, biztonság, hatásosság vizsgálatához.
4. Klinikai fázis III: 1000-5000 betegen a biztonságosság,
hosszú távú hatásosság igazolására.
Egy új gyógyszer molekula megtalálása, bevezetése 15 évig
is eltarthat és költsége 500 millió USA dollár körüli!
Génterápiás próbálkozások-még nem klinikai
kipróbálás szintjén:
Mikro gén bevitele: adeno-asszociált vírus vektorral (AAV) mini
dystrophin cDNS bevitele (hiányzik a 17. exon egy része és 1859-ig az összes, valamint a 70-79-es exonok). Nem gyógyít,
BMD formává transzformál. Nem mutáció specifikus, minden
DMD-s beteg kaphatja majd (Biostrophin inj.)
Gén transzfer plazmiddal (kis cirkuláris „csupasz” DNS-el): a
teljes gén kódoló és szabályozó régióival.
Myoblast sejt transzplantáció (Kanada): átmeneti javulás, újabb
próbálkozás: myostatin blokkolás kíséretében. Egyelőre
immunosuppresszív terápiával.
Őssejtekkel: lehetséges izom regeneráció:
differenciálódó (Pax3 transzkripciós faktor segítségével) embrionális
őssejtek közül kinyert myogen sejtekkel (intakt dystrophin génnel),
izom őssejtekkel (mesoangioblastok és pericyták), mini cDNS-el
korrigálva,
Genetikailag exon-kiütött saját őssejtekkel (szatellita sejtek).
Terápia farmakológiai ágensekkel:
Utrophin gén (kr. 6, 75 exon) „aktiválás”, mivel a kódolt fehérje (Autrophin) a dystrophin magzati formája. Bíztató eredmények: SMT
C1100-val, biglycan (szisztémás inj.). Utrophin gén bevitellel is
próbálkoztak.
Myostatin gátlás ellenanyaggal (Myo-029), mivel aktiválódva az
izomsejt-magban blokkolja az „izom-képző” géneket. Nem volt tartós a
hatás.
Gyulladásos ágensek blokkolása (pl. szteroidok, Galectin-1,
szulfaszalazin stb),
Antioxidánsok (koenzim Q10 származék: Idebenone, vagy a
Protandim) a légzés, szívműködés javítására.
Orális glutamin supplementáció DMD-ben, fázis: II stádium, a
vizsgálat helye: Poitiers, Franciaország. Csökkenti a teljes test protein
degradációját.
I/a: génterápia antisense oligonukleotiddal: PRO051el, fázis I-II. (exon 51 ellen, helye: Leiden, Hollandia
18 résztvevő (5-16 év közötti DMD-s fiúk) kapta subcutan (localis
vizsgálat), egy karba, hetente 1x, 5 héten át (2008. 04.-2009. 02.
között zajlott). Ezután izomerő és funkció mérés. Az „exon skipping”
technika nem gyógyít, a DMD-t BMD-vé próbálják átalakítani,
csökkenteni a tünetek súlyosságát.
Feltétel: PRO051-el (2’ o-metil-antiszenz oligoribonukleotid, kémiailag
védet rövid RNS darabkák,) korrigálható mutáció jelenléte (előtte in
vitro PRO051 screening módszerrel ellenőrzés). Eredményes volt: del
50, 52, 48-50, 49-50 esetén. A pre-mRNS-en belül csak ahhoz a
szakaszhoz kötődnek, és sehova máshova, melyet el akarunk távolítani
(a „splicing”-ot befolyásolják).
A Prosensa (holland cég) újabb antisense oligoi a következő exonokat
távolítják el: 43, 44, 45, 46, 50, 52, és 53 (a kék színűek elsőbbséget
élveznek kereskedelmi okokból).
I/b: génterápia antisense oligonukleotiddal: (AVI4658, morpholino oligomer, exon 51 ellen), fázis I-II.
(London)
Kilenc 14 év feletti DMD-s fiúnál próbálták, akik már
tolókocsisok lettek, localisan (extensor digitorum brevis)
(2006. 01.-2008. 01.-ig). Helye: Hammersmith Hospital,
London (Cég háttér: AVI BioPharma Inc., Oregon).
Szisztémás kezelést is terveznek. Del. exon 50 esetében:
exon 49 vége
l
start exon 51
pro051: UC-UUU-ACG-GUA-GAA-GGA-ACU-
CAG-CCA-GUG-AAG l CUC-CUA......UGG-UGA-CAC...AAC-UAG-AAA-UGC-CAU-CUU-CCU-UGA
gln pro val lys l leu leu........trp stop
Az exon 50 deletioját az exon 51 eltávolítása követi és a 49. exon végének a
kodonja az 52. exon elejének komplett kodonjával folytatódik („in frame”):
exon 49 vége
l start exon 52
CAG-CCA-GUG-AAG l GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG- 77 aminosavval rövidebb a keletkezett
gln pro val lys l ala thr met gln asp leu
protein
I/c: génterápia PTC124-el DMD/BMD-s korai
stop kodon mutációk esetén: fázis: IIb.
165 fiún (Európából, É-Amerikából, Izráelből, Ausztráliából összegyűjtve)
végzett vizsgálatok, akik 5 év felettiek, és 75 métert még tudnak
gyalogolni. Cél: a stop codon átugrásával (reading through) dystrophin
képzés beindítása szájon át bevehető tablettával (naponta 3x1, 48 hétig,
vízben vagy tejben oldva). 6 hetente kiértékelés az izomfunkciót,
izomerőt, aktivitást, járást és biztonságot illetően.
Elve: a betegek kb. 13-15%-ánál pontmutáció miatt stop kodon állítja le
a fehérje szintézist (UGA, UAG, UAA, nonsense mutáció). A PTC124 (800
000-ből találta meg a PTC Therapeutics, New Jersey) a leolvasást ezen
„átugratja”, a normál stop codont nem befolyásolja! Vér CK
Vizsgálati helyek:
Franciaország: Párizs,
Németország: Freiburg, Essen (2008. 02.-2010. 08.)
Olaszország: Róma
Egyesült Királyság: Newcastle University.
IV. DMD-s fiúk cardioprotektív
terápiája
Béta blokkolók: Carvedilol versus Ramipril
vizsgálata (2008-2011), Rómában.
Pentoxifylline, fázis I-II, Páviában,
SNT-MC17/idebenone (antioxidáns, 8-16 éves
DMD-s fiúk esetén), Svájcban.
Perindopril ACE gátló hatása a DMD korai
fázisában. Két éves, kettős vak, randomizált,
placebo kontrollált vizsgálat. Helye:
Franciaország, Hopital Necker, Párizs.
Génterápiára hívott betegeink:
H. L., dystrophin géndeletioja: del 45-50
(out-of frame, de del 45-51: in frame
lenne!)
G. J., dystrophin géndeletioja: del 47-52
(out-of-frame, de 47-53: in frame lenne!)
Sajnos egyikük sem érte meg ezt a
lehetőséget!