Transcript Genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen
Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet
Genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen från pACYC184
Årskull: Laborationsrapport i molekylärbiologisk labmetodik, termin 4 Handledare:
Abstrakt
Plasmiden pACYC184 har en gen som kodar för tetracyklinresistens. Genen digererades och ligerades in till pUC19 som användes som vektor för att transformation av plasmiden till E.coli. Fragmentet är på 2721bp och digererades med hjälp av restriktionsenzymerna HindIII och EcoR1. Proverna analyserades på agaroselektrofores med λ -standard för att kontrollera så enzymerna klippt ut fragmenten. Plasmiderna renades fram från det klippta DNA fragmentet och ligerades med hjälp av T4 DNA-ligase. Transformationen skedde genom att plasmiderna tillsattes till kompetenta celler (DH5 α ) och hettades upp till 42°(heatshock). SOC medium tillsattes och bakterierna inkuberades med skak i 60 minuter för fenotypisk expression. De transformerade cellerna spreds sedan ut på två stycken LA plattor (ampicillin/x-gal och en med tetracyklin) och inkuberades över natten. Med hjälp av Polymerase Chain Reaction (PCR) kunde en mångfald fås av DNA-fragment från tetracyklinresistensgenen. Nybildade PCR produkten analyserades därefter på gelelektrofores. Syfte med laborationen var att överföra rekombinant tetracyklinresistens till E.coli genom genkloning. Slutsatsen är att det är svår laboration eftersom önskat resultat inte uppnåtts.
Introduktion
Plasmiden pACYC184 (4244bp) från
E.Coli
har en tetracyklin-gen som kodar för tetracyklinresistens. Denna insert-gen kan överföras till plasmiden pUC19(2686 bp) genom att den specifika genen digereras. Digerering sker med restriktionsenzymer som till exempel EcoR1 och HindIII. Fragmentet som klipps ut är på 2720bp och överförs till pUC19 som används som en vektor eftersom den har ett högre kopietal. HindIII är ett restriktionsenzym från bakterien
Haemophilus influenzae
. HindIII klyver DNA-strängarna vid AAGCTT sekvensen och skapar så kallade sticky ends eftersom den inte klyver rakt av. EcoR1 är ett restriktionsenzym från bakterien
Escherichia coli
och används för att öppna plasmidvektorer för att sedan kunna sätta in en specifik gen. EcoR1 klipper vid GAATTC sekvensen och skapar också sticky ends. Samma restriktionsenzymer används också på pUC19 som har en multikloningssite som känns igen av flera olika restriktionsenzym. Fragmentet digereras så att ligering av resistensgenen ska vara möjlig. För att kontrollera så att enzymerna har klippt DNA-sekvenserna från plasmiderna gör man en agaroselektrofores, där en λ -DNA standard används. Fragmenten sätts ihop med hjälp av enzymet ligas. Med pUC19 som vektor för tetracyklinresistens överförs materialet till en bakterie via transformation. E.coli har låg kompetens att ta upp fritt DNA men kan med hjälp av kemiska och fysikaliska metoder göras kompetenta. Iskall kalciumklorid(CaCl 2 ) används för att inkubera proverna på is så DNA lättare binder till bakterie ytan. Transformation in till bakterier kan ske på konstgjord väg med hjälp av tre olika metoder, Heat chock, elektroporering och kemiskt. Vid heat-chock transformering sänks temperaturen så att bakterierna kyls ner och därefter höjs temperaturen till cirka 40 grader. För att plasmid DNA ska finnas stabilt i cellen måste den innehålla origin of replication, vilket medför att kloner av plasmiden bildas oberoende av cellens replikering. Eftersom transformationen oftast bildar en blandning av lite transformerade celler och ett överflöd av icke-transformerade celler används en metod där identifiering av celler med de nya plasmiderna. Metoden bygger på att en gen överförs som ger bakterien resistens mot antibiotika de normalt slås ut av. De transformerade cellerna kan då växa på LA plattor med tetracyklin/ampillicin. Vektorn pUC19 har en lacZ’gen som kodar för alfa-delen av enzymet betagalaktosidas. Genen inaktiveras när ett inklonat fragment ligerats. Eftersom genen inaktiveras kan inte laktos brytas ner inne i bakterien. Är lacZ’ genen funktionell bildas enzymer som bryter ner x-gal vilket gör att blå kolonier bildas. Är genen inaktiverad bildas vita kolonier. X-gal används på detta sätt för att kontrollera om vektorn har fått ett inklonat fragment. Polymerase chain reaction(PCR) är en metod som har stort användningsområde inom genteknik. PCR används för att analysera och verifiera en konstruerad plasmid. PCR-principen delas in i tre stycken delsteg, denatureringstemperatur där provet hettas upp till 94° och DNA-strängarna separeras. Annealingstemperatur beräknas för att veta smälttemperaturen så att primrarna kan fästa till DNA fragment. Primer för tetracyklin-genen är tet reverse (5’-CGG TCC AGT GAT CGA AGT TA-3’) och tet forward (5’-AAT GCG CTC ATC GTC ATC CT-3’). Extensionstemperatur som används är vanligtvis 72° som är lite under optimum för Taq-polymeras och det är då strängarna förlängs och blir dubbelsträngade. Taq-polymeras används eftersom det klarar högre temperaturer och kan därför
användas under hela PCR-reaktionen. Nya DNA strängar syntetiseras och den nybildade PCR produkten analyseras med gelelektrofores. Syfte med laborationen är att överföra rekombinant tetracyklinresistens till E.coli genom genkloning. Slutsats är att det är svår laboration eftersom resultatet inte lyckades. (1)
Metod och material
Digerering
Plasmiderna pUC19 och pACYC184 digererades i varsitt eppendorfrör. I rör 1 blandades 10 μ L pUC19, 3 μ L 10X buffert (0+ with BSA, från EcoR1-kit), 1 μ L EcoR1 (MBI Fermentas Helsingborg, Sverige), 1 μ L HindIII (MBI Fermentas Helsingborg, Sverige), och 15 μ L milliQ-vatten. I rör 2 blandades 15 μ L pACYC184, 3 μ L 10X buffert, 1 μ L EcoR1, 1 μ L HindIII och 10 μ L milliQ-vatten. Rören inkuberades i 37°C under ett dygn.
Agaroselektrofores ( Agarose IBI, Shelton Scientific Inc, USA)
Två geler tillverkades med 1,0% agaros gel i 0,5x TBE. Blandningen kokades i mikrovågsugn ca 1 minut. Lösningen hälldes i tråg och stelnade till en gel. Från vardera digering togs 8 μ l och blandades med 2 μ l loading buffert i separata eppendorfrör. Proverna applicerades till agarosgelen. En molekylviktsstandard (1 μ l λ –DNA standard (MBI Fermentas, Helsingborg Sverige) , 8 μ l H2O, 2 μ l loading buffert) tillsattes i en brunn. Elektroforesen utfördes vid 80 V och gick 1 timme. Gelen färgades in i 0,5 μ g/ml EtBr i 2-4 minuter. Avfärgades 10-15min i vatten. Gelen placerades på UV-bord och fotograferades.
Fenolextraktion, etanolprecipitation och ligering
Digereringarna späddes till 200 μ L med sterilt vatten och 200 μ L fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) tillsattes. Rören blandades på vortex 15 sek. och centrifugerades sedan 2 min. 13000rpm. De översta skikten, vattenfasen, sögs av till nya rör. En tiondels volym NaOAc 3M och tre volymer iskall 99,5% EtOH tillsattes och blandades i vardera rör, varefter de inkuberades i -80°C tills de blev trögflytande. Proverna centrifugerades i kylcentrifug 15min. vid 13000rpm. Supernatanterna sögs av och 1mL iskall 70% EtOH tillsattes. Proverna kylcentrifugerades åter 5min. Supernatanterna sögs av. Kvarvarande DNA-pellets torkades i värmeskåp och resuspenderades därefter i 20 μ L sterilt vatten. För ligering av plasmidfragment tillsattes i ett eppendorfrör 4 μ L pUC19-suspension, 10 μ L pACYC suspension, 4 μ L 5x ligasbuffert, 3 μ L sterilt vatten och sist 1 μ L T4 DNA-ligase (Invitrogen, Carlbad ,USA). Detta cetrifugerades 2 sek. och inkuberades sedan över natten i ett 16°C vattenbad.
Transformation
Till ett nytt eppendorf rör tillsattes försiktigt 10 μ L av pUC19/pACYC-ligeringen och 50 μ L kompetenta DH5 α -bakterier (Invitrogen, Carlbad, USA). Suspensionen inkuberades på is 30min, värmechockades därefter 30sek. i 42°C och kyldes sedan på is under 2min. Suspensionen tillfördes 200 μ L rumstempererat SOC-medium. Den inkuberades i 37°C med skak, 225rpm, under 60min för fenotypisk expression. På en förvärmd LA-platta (50 μ g/mL amp, 50 μ g/mL x-gal) och en LA-platta (50 μ g/mL amp, 20 μ g/mL tet), ströks 100 μ L vardera av transformerade DH5 α . Plattorna inkuberades i 37°C över natten.
Omstryk av transformanter
Nio kolonier från amp/x-gal-plattan ströks på en ny amp-platta med nummeridentifikation ett till nio. På samma platta ströks tre kolonier från top 10 platta (kolonier med tet-resistens) med nummeridentifikation 19 till 21.
PCR
Kolonier med nummer identifikation 19 och 21 suspenderades i varsitt 1,5ml eppendorfrör med 20 μ l sterilt vatten. Rören ställdes på värmeblock 95°C i 5min för att göra templat. I två 0,5ml eppendorfrör tillsattes en mastermix (18 μ l H2O, 2,5 μ l 10X buffert, 0,5 μ l dNTP 10 mmol, 1 μ l Primer tet F (DNA Technology A/S, Denmark) (10pmol), 1 μ l Primer tet R (DNA Technology A/S, Denmark) (10 pmol), 1 μ l DyNAzyme II DNA polymerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) och 1 μ l templat. PCR analysen utfördes i en PCR-apparat (PTC-100, MJ Research Inc.) ca. 1,5 tim. PCR Program: fem min. 95°C denaturering. 28 cykler av 95°C 30sek., 55°C 30 sek. och 72°C 60 sek. Tio min. 72°C. Nedkylning till 4°C. Rören ställdes i kyl över natten.
Analys av PCR
Till rören adderades 5 μ l 6X loading buffer. Till en 1%-agaros gel tillsattes 10 μ l av varje prov samt en λ -standard och elektrofores utfördes enl. tidigare beskrivning.
Resultat
I figur 1, brunn fem kan tydliga fragment av klippt pACYC ses. I brunn sex syns ett band från klippt pUC19 eftersom det lilla fragmentet är på ca 50bp. Resultatet från elektroforesen ger storleken på pACYC184 3800bp och pUC19 på 2450bp. Ampillicin-plattan visar tydlig tillväxt av vita kolonier, men inga blå. Amp/tet-plattan hade nollväxt. Resultatet från gelelektroforesen med det nysyntetiserade DNA-materialet visade inte några band.
Diskussion
Gelelektroforesen av de digererade plasmiderna ser ut att visa ett lyckat resultat, dock lite svårt att avgöra storleken på fragmenten då λ -standarden för jämförelse inte visade något, därför jämfördes resultatet med en annan λ -standard och tyder på ett relativt bra resultat. Rören med de ligerade plasmiderna försvann olyckligtvis mellan dag två och tre, så en annan grupps ligering fick lov att användas. Orsaken att amp/tet plattan inte hade någon växt beror möjligen på för hög tetracyklinkoncentration. Resultatet från gelelektroforesen med det nysyntetiserade DNA materialet visade på misslyckat resultat eftersom band inte syns på gelen. Möjligen på grund av för kort infärgningstid eventuellt att fel spänning användes.
Referenser
1) 2) T.A. Brown,
Gene cloning and DNA analysis, an introduction
, Wiley-Blackwell 2010 http://www.fermentas.com/templates/images/tiny_mce/1216984323.gif 3) http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.fermentas.com/techinfo/N ucleicAcids/img/npuc18_19.gif
Figurer
Figur1. Agaroselektrofores på pUC19, pACYC184 digererad med EcoR1 och HindIII samt en λ standard som kontroll. Figur2. Agaroselektrofores på nysyntetiserat DNA-material från tetracyklin-gen som analyserats med PCR-teknik. PCR templat från TOP10/pUC+tet. Prov 1, 2 en positiv kontroll bestående av pACYC184 samt en λ -Standard.
Bilaga 1
: Genkartor på plasmiderna som användes i laborationen.
Bilaga 2:
Riskbedömning av fenol/kloroform/isoamylalkohol
På vilket sätt är kemikalien farlig?
ÖGON: kan orsaka allvarilg irritation och möjligen hornhinneskada. HUDKONTAKT: orsakar rodnad och sveda. Kan orsaka frätskador. FÖRTÄRING: giftigt vid förtäring. Kan orsaka njurskador.. Kraftig irritation med buksmärtor, illamående, kräkningar och diarré. INANDNING: irriterar andningsvägarna med hosta, heshet. Kan i höga koncentrationer ge lungödem. Viss risk för cancer kan inte uteslutas efter ofta upprepad exponering.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
UNDVIK ALL KONTAKT! Hantera ej öppna förpackningar utan skyddsutrustning. Arbeta i dragskåp. Laboratorierock, skyddsglasögon och skyddshandskar. Använd flerskiktshandske (t ex 4H).
Skyddsåtgärder
INANDNING: FÖRTÄRING: Flytta genast den skadade till frisk luft. Ge konstgjord andning om andningen har stoppat. Håll den skadade varm och i vila. Omedelbart till läkare! Vid medvetslöshet, lossa åtsittande kläder och placera den skadade i framstupa sidoläge. Försök inte ge vätska eller framkalla kräkning om den skadade är medvetslös. Ge genast den skadade flera glas vatten. Ge mjölk i stället för vatten om sådan är tillgänglig. Omedelbar läkarhjälp eller transport till sjukhus. Vid medvetslöshet, lossa åtsittande kläder och placera den skadade i framstupa sidoläge. HUDKONTAKT: Skölj genast huden med tvål och vatten. Avlägsna genomfuktade kläder och fortsätt skölja. Viktigt att ämnet omedelbart avlägsnas från huden. Omedelbart till läkare om symptom uppträder efter tvättning. STÄNK I ÖGONEN: Spola GENAST ögonen med mycket vatten. Håll ögonlocken brett isär. Fortsätt att skölja i minst 15 minuter medan läkare kontaktas.
Avfallshantering
Lämnas för destruktion enl. lokala föreskrifter.
Källa:
http://www.fishersci.se/safenet/pdf/04636555.pdf
Bilaga 3:
Riskbedömning av Etidiumbromid
På vilket sätt är kemikalien farlig?
ÖGON: kan irritera ögonen. HUDKONTAKT: irriterar huden, farligt vid hudabsorbtion. Kan förorsaka eksem. FÖRTÄRING: kan ge illamående, kräkningar och diarré. INANDNING: irriterar andningsvägarna. Kan vålla förgiftning. Kan ge ärftliga genetiska skador.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
UNDVIK ALL KONTAKT. Hantera ej öppna förpackningar utan skyddsutrustning. Arbeta i dragskåp. Använd dammfiltermask vid risk för dammbildning. P2 (dammfilter, fint damm). Använd flerskiktshandske (t ex 4H). Dammtäta skyddsglasögon vid risk för dammbildning. Laboratorierock, skyddsglasögon, skyddshandskar och andningsskydd.
Skyddsåtgärder
INANDNING: FÖRTÄRING: Flytta genast den skadade till frisk luft. Ge konstgjord andning om andningen har stoppat. Håll den skadade varm och i vila. Omedelbart till läkare! Skölj munnen ordentligt och ge rikligt med mjölk/vatten förutsatt att den skadade inte är medvetslös. Kontakta läkare. HUDKONTAKT: Tvätta huden noggrant med tvål och vatten i flera minuter. Kontakta läkare om irritationen kvarstår efter tvättning. STÄNK I ÖGONEN: Skölj genast ögonen med mycket vatten. Fortsätt att skölja i minst 15 minuter. Kontakta läkare om irritationen kvarstår.
Avfallshantering
Lämnas för destruktion enl. lokala föreskrifter. Ventilera till frisk luft.
Källa: