Transcript Holdbarhet og verifisering

Det helsevitenskapelige fakultet, institutt for medisinsk biologi
Holdbarhet og verifisering
Av BD Vacutainer Rapid Serum Tube og BD Vacutainer SSTTM II
Advance
—"
Kandidatnummer: 6 og 11
Bacheloroppgave i Bioin-112 Våren 2014
30.05.2014
Forord:
Våren 2014 avslutter vi vår utdanning som Bioingeniør, ved UIT – Norges Arktiske
Universitet. I den forbindelse har vi skrevet en avsluttende bacheloroppgave. Oppgaven
handler om å undersøke holdbarheten for noen analytter og verifisering av en type prøveglass,
etter ønske fra Laboratoriemedisin ved Universitetet Nord-Norge (UNN). Den praktiske delen
ble gjennomført på ca.14 dager ved UNN.
Oppgaven er basert på det praktiske arbeidet, teorien, ulike kilder, og i tillegg erfaringen vi
har, etter 1 års ansettelse på avdelingen Laboratoriemedisin ved UNN. Den er rettet mot
bioingeniører, fagarbeidere innenfor laboratoriet, generelt interesserte og lignende.
Vi vil rette en stor takk til laboratoriemedisin, for at vi fikk gjennomføre dette forsøket. Vi vil
også takke vår praktiske veileder Inger Myrnes, som er ansatt på laboratoriemedisin. Inger har
hjulpet oss i planlegging, tilrettelegging og utførelse, hun har også vært tilstede for diskusjon
og spørsmål. I tillegg vil vi takke vår skriveveileder Kirsten Raanaas Huseby ved
Universitetet i Tromsø, for detaljert og god veiledning på oppgaven. Vi vil til slutt takke alle
sammen for et godt samarbeid.
Tromsø 30. Mai 2014
Sammendrag:
Laboratoriemedisin ved Universitetssykehuset Nord-Norge bruker BD Vacutainer SSTTM II
Advance (SST) glass for analyser i serum. I enkelte tilfeller brukes BD Vacutainer Rapid
Serum Tube (RST) glass som en erstatter. RST glass har kort koagulasjonstid, og kan derfor
sentrifugers og analyseres etter kort tid, og igjen gi et raskere svar til rekvirent. Laboratoriet
ønsker derfor å undersøke om RST glass gir samme prøvesvar som SST glass for tre ulike
analytter. De tre analyttene som skal verifiseres er insulin, Connecting-peptid (C-peptid) og
fritt trijodtyronin (FT3). Samtidig ønsker de å få kontrollert holdbarheten for de nevnte
analyttene og N-terminal pro-brain natriuretisk peptid (NT proBNP) i SST og RST glass.
For å sammenligne RST glass med SST glass for de gitte analyttene, ble det til sammen
innsamlet 50 polikliniske prøver; 25 SST og 25 RST glass. Disse ble analysert på Cobas 8000
Modular E602 ved UNN. I holdbarhetsstudiet ble det tatt til sammen 10 prøver av en frivillig,
5 av hver type prøveglass. Disse prøvene ble analysert hver dag i 7 dager , sammen med
donorkontroller. Donorkontrollene ble oppbevart i fryser med en temperatur på -70°C, mens
prøvematerialet ble oppbevart i kjøleskap med en temperatur på 2-8°C.
Ut fra resultatene i verifiseringsstudiet kan vi konkludere med at RST glassene gir samme
prøvesvar som SST glassen for insulin, C-peptid og FT3. Laboratoriet kan derfor bruke RST
glassene som en erstatter for SST glassene. Gjennom holdbarhetsstudiet fant vi ut at
holdbarheten for insulin, C-peptid, FT3 og NT proBNP har en holdbarhet på 7 dager i RST
glass ved 2-8°C. NT proBNP har også en holdbarhet i SST glass på 7 dager, ved samme
temperatur.
Innholdsfortegnelse!
1.0 Innledning:!..................................................................................................................................................!1!
2.0 Teori:!............................................................................................................................................................!2!
2.1 Instrument:"......................................................................................................................................................................."2!
2.1.1 Cobas 8000 Modular E602:!..........................................................................................................................!2!
2.2 Måleprinsipp:".................................................................................................................................................................."3!
2.2.1 Immunoassay:!...................................................................................................................................................!3!
2.3 Prøverør:".........................................................................................................................................................................."6!
2.3.1 BD Vacutainer SSTTM II Advance:!........................................................................................................!6!
2.3.2 BD Vacutainer Rapid Serum Tube (RST) Thrombin:!.....................................................................!6!
2.4 Analytter:".........................................................................................................................................................................."7!
2.4.1 Insulin:!.................................................................................................................................................................!7!
2.4.2 C-peptid:!.............................................................................................................................................................!8!
2.4.3 Fritt T3:!...............................................................................................................................................................!9!
2.4.5 NT ProBNP:!...................................................................................................................................................!10!
2.5 Forsøk:"..........................................................................................................................................................................."11!
2.5.1 Holdbarhet:!.....................................................................................................................................................!11!
2.5.2 Verifisering:!....................................................................................................................................................!11!
2.6 Feilkilder:"......................................................................................................................................................................"11!
2.6.1 Preanalytiske feilkilder:!..............................................................................................................................!11!
2.6.2 Analytiske feilkilder:!...................................................................................................................................!12!
2.6.3 Postanalytiske feilkilder:!............................................................................................................................!13!
2.6.4 Biologisk variasjon:!.....................................................................................................................................!13!
3.0 Material og metode:!................................................................................................................................!14!
3.1 Biologisk variasjon:".................................................................................................................................................."14!
3.2 Kontroller, reagens og utstyr:"..............................................................................................................................."15!
3.3 Fremgangsmåte:"........................................................................................................................................................."16!
3.3.1 Holdbarhet:!.....................................................................................................................................................!16!
3.3.2 Verifisering:!....................................................................................................................................................!17!
3.4 NKK regneark:"............................................................................................................................................................"18!
4.0 Resultater:!................................................................................................................................................!19!
4.1 Kontroller:"...................................................................................................................................................................."19!
4.2 Holdbarhetsforsøk:"...................................................................................................................................................."22!
4.3Verifisering:!.........................................................................................................................................................!25!
5.0 Diskusjon:!.................................................................................................................................................!28!
5.1 Holdbarhet:"..................................................................................................................................................................."28!
5.1.1 Insulin:!..............................................................................................................................................................!28!
5.1.2 C-peptid:!..........................................................................................................................................................!28!
5.1.3 FT3 III:!.............................................................................................................................................................!28!
5.1.4 NT proBNP:!...................................................................................................................................................!29!
5.2 Verifisering:".................................................................................................................................................................."29!
5.2.1 Insulin:!..............................................................................................................................................................!30!
5.2.2 C-peptid:!..........................................................................................................................................................!30!
5.2.3 FT3:!...................................................................................................................................................................!31!
6.0 Konklusjon:!..............................................................................................................................................!31!
Kilder:!
Vedlegg:!
Vedlegg"1:""Resultater"for"insulin!
Vedlegg"2:"Resultater"for"C>peptid!
Vedlegg"3:"Resultater"for"FT3"III!
1.0 Innledning:
Laboratoriemedisin ved Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN) i Tromsø er delt opp i
flere seksjoner. Innen fagområdet biokjemi analyseres de fleste serum prøvene. Disse prøvene
blir tatt på BD Vacutainer SSTTM II Advance (SST) glass og analysert på Cobas 8000, i
vanlig rutine. I senere tid har BD Vacutainer Rapid Serum Tube (RST) glass kommet på
markedet og erstattet SST glass i ulike situasjoner på UNN. Fordelen med RST glassene er at
de har kort koaguleringstid som medfører at et raskere prøvesvar kan foreligge hos rekvirent.
Denne oppgaven er basert på et holdbarhetsstudie av fire analytter, i SST- og RST glass.
Analyttene vi bruker i studie vårt er Insulin, Connecting peptide (C-peptid), fritt trijodtyronin
(FT3) og N-terminal pro-brain natriuretisk peptid (NT proBNP). Laboratoriet har mottatt ny
versjon av hormonet FT3 (FT3 III). Den nye versjonen har nye reagenser, laboratoriet vil
derfor undersøke om reagensene har samme egenskaper for holdbarhet som
pakningsvedlegget opplyser.
I pakningsvedlegget fra Cobas opplyses det at prøvene, Insulin og C-pepetid er holdbart i 24
timer i serum ved 2-8 °C. Fritt T3 III er holdbar i 7 dager og NT proBNP holdbar i 6 dager i
serum ved samme temperatur. På UNN har de tidligere testet holdbarheten for Insulin, Cpeptid og FT3. Ut fra studiet konkluderte de med at anlyttene har en holdbarhet på 7 dager
ved 2-8 °C. Med tanke på kvalitet og sikkerhet ønsker laboratoriet å kontrollere NT proBNP,
da det ikke er blitt utført tidligere. Når det gjelder RST glassene er det ikke blitt gjennomført
noen holdbarhetsstudier for de fire analyttene. Et slikt studie er derfor ønskelig fra
laboratoriet. (1, 2, 3, 4) I tillegg til holdbarhetsstudiet skal vi utføre et sammenligningsforsøk
mellom RST- og SST glassene, for å påvise at kvaliteten for RST glassene er optimal.
Problemstilling:
Hvor lang holdbarhet har de nevnte analyttene i RST glass, og er holdbarheten for NT
proBNP 7 dager, i SST glass? Og vil de to glasstypene gi samme prøvesvar for insulin, Cpeptid og FT3?
!
1!
2.0 Teori:
2.1 Instrument:
2.1.1 Cobas 8000 Modular E602:
Analyseinstrumentet Cobas 8000 brukes blant annet innenfor analyser i medisinsk biokjemi
og legemidler. I denne oppgaven, som handler om immunoassayanalyser, ble prøvene
analysert på Modular E602. Modular E602 er en av flere komponenter som Cobas 8000 består
av. (5)
Med Modular E602 analyseres 80 ulike analyser. Alt fra hjerte- og infeksjonssykdommer til
beinmarkører, hormoner, revmatoid artritt og tumormarkører kan påvises. Metoden baserer
seg på elektrokjemiluminicens immunoassay. Instrumentet har kapasitet til å analysere rundt
170 prøver hver time og er installert for å oppnå høy kvalitet, raskt og effektivt. (5)
Figur!1:!!Cobas!8000,!Modular!E602.!Eget!bilde.!
Når prøvene skal analyseres, plasseres de i rack. Rackene som blir brukt på Cobas 8000 har
egne ID-merker, strekkoder, og har plass til 5 prøverør. Prøverørene kan enten legges inn
manuelt eller bli gjenkjent av instrumentet med deres unike barkoder. Barkodene er knyttet
opp mot de analyttene som er rekvirert på hver enkelt pasient. I instrumentet blir
prøvematerialet fordelt og pipettert med engangspipetter i engangskopper. Her blir
!
2!
prøvematerialet blandet, inkubert og sugd opp av en zipperprobe, som vaskes godt mellom
hver prøve. Zipperproben overfører videre prøven til målcellen. Modular E602 har 1
målceller. Etter at prøvene er analysert, blir rackene sendt ut av instrumentet og direkte til
kjøleskap, eller så blir prøvene korket manuelt. Deretter blir de satt i kjøleskap for
oppbevaring. (6)
2.2 Måleprinsipp:
2.2.1 Immunoassay:
Immunoassay, også omtalt som elektrokjemiluminescens (ELISA) som er en kvantitativ
målemetode der bestemte antistoff binder seg til spesifikke antigen. Målemetoden brukes
innen laboratoriet for å kvantitere hormon, hjertemarkører, kreftmarkører, virus med flere.
Non-kompetitiv og kompetitiv er to måleprinsipp, basert på immunoassay. (7)
2.2.2 Sandwich prinsipp:
Sandwich prinsippet blir også omtalt som en non-kompetativ metode. Metoden kan kvantitere
antigen (eller antistoff). (8) Den spesifikke analytten i prøvematerialet reagerer med
biotinylert monoklonalt analytt-spesifikt-antistoff og danner et kompleks. Deretter tilføres
monoklonalt analytt-spesifikt-antistoff merket med ruteniumkompleks. Dette reagerer og
danner et sandwich-kompleks, vist som trinn 1 i figur 2. Til slutt tilsettes streptavidin-coatede
mikropartikler. Disse reagerer med det biotinylerteantistoffet, slik at komplekset blir til fastfase, vist som trinn 2 i figur 3. (2, 3, 4, 8)
Reaksjonsblandingen som er dannet, suges opp til målcellen. Her blir fast-fase komplekset
fanget magnetisk på elektrodeoverflaten. Dersom det er ubundne stoffer tilstede, vaskes disse
vekk. Elektroden tilføres spenning som gir kjemiluminisensemisjon når komplekset binder
seg. Signalintensiteten som oppstår, måles med en fotomultiplikator. Konsentrasjonen av
analytten beregnes automatisk ut fra instrumentet, ved hjelp av en kalibreringskurve som er
analytt spesifikk. Signalet fra de bundne komplekser er proporsjonal med mengden antigen.
(2, 3, 4, 8)
!
3!
Figur 2: Trinn 1 i sandwich prinsippet. (6)
Analytten i prøvematerialet reagerer med biotinylert monoklonalt analytt-spesifikt-antistoff,
deretter tilsettes monoklonalt analytt-spesifikk-antistoff merket med retenium. Til sammen
danner de et sandwich kompleks, som vist på figur 2.
Figur 3: Trinn 2 i sandwich prinsippet. (6)
Til slutt tilsettes streptavidin-coatede mikropartikler, som reagerer med det
biotynilerteantistoffet på sandwich komplekset og danner fast-fase.
2.2.3 Kompetitivt prinsipp:
Den kompetitive metoden brukes til å kvantitere små antigen. (9) Den spesifikke analytten i
prøvematerialet reagerer med analytt-spesifikt antistoff merket med ruteniumkompleks, vist
som trinn 1 i figur 4. Deretter tilsettes biotinylert analytt og steptavidin-coatede
mikropartikler. Biotinylert analytt reagerer og fester seg på ledige analytt-spesifikt antistoff
merket med ruteniumkompleks. Binding mellom biotin og streptavidin danner et fast-fase
kompleks, som vist som trinn 2 i figur 5. Slik som det er beskrevet i sandwich-prinsippet blir
reaksjonsblandingen sugd opp til målcellen og fast-fase komplekset festes til
elektrodeoverflaten. Ubundene stoffer vaskes bort. Måling og avlesningen av analyttene i
!
4!
prøvematerialet skjer på samme måte som i sandwich prinsippet. (1) Konsentrasjonen av
analyttene i prøvematerialet, er omvendt proporsjonal til signalet fra bundende kompleks. (9)
Høye verdier av analytten tilsier at det er mye analytter tilstede i prøvematerialet, og alle
rutinmerkede antistoffer blir opptatt. Målesignalet er lavt eller lik null. Dersom det er lave
verdier av analytten i prøven vil de biotinmerkede analyttene binde seg. Signalet vil være
høyt. (9)
Figur 4: Trinn 1 i kompetitiv prinsipp. (Roche diagnostic)
Analytten i prøvematerialet reagerer med anti-analytt-spesifikt antistoff merket med retenium.
Figur 5: Trinn 2 i kompetitiv prinsipp. (Roche diagnostic)
Deretter tilsettes biotinylertanalytt og streptavidin-coatede mikropartikler. Biotinylert analytt
reagerer med frie analytt-spesifikt antistoff merket med retenium. Streptavidin-coatede
mikropartikler reagerer med biotynilertanalytt og danner fast-fase.
!
5!
2.3 Prøverør:
2.3.1 BD Vacutainer SSTTM II Advance:
Prøverørene BD Vacutainer SSTTM II Advance (SST) blir ofte omtalt som vanlig
serumglass med gel, på laboratoriet. Disse prøverørene benyttes til ulike analyser. Blant annet
medisinsk biokjemi, legemiddel og immunoassay.
Rørene har et vakuum, som gjør at de blir fylt med et kjent blodvolum. SST glassene finnes i
ulike størrelser. Veggen i prøverørene er coated med tørre mikroskopiske silica partikler.
Disse er negativt ladd. Når blodplatene kommer i kontakt med partiklene, reagerer de og
koaguleringen starter. Etter prøvetakning er det derfor viktig at prøvematerialet blir godt
blandet. Rørene vendes 5-6 ganger. På bunnen av glassene er det en gel. Etter sentrifugering
vil gelen vandre opp langs veggen, på grunn av dens viskositet og tetthet. Dette medfører at
blodlegemer og serum skilles. (10, 11)
Etter at prøven er tatt, må den stå i romtemperatur og koagulere i 30 minutter før
sentrifugering. Dette er opplyst i pakningsvedlegget av produsent. Prøveglassene
sentrifugeres i 10 minutter med en hastighet mellom 2000 g i romtemperatur. (10, 11)
SST glass brukes i rutinen og serumprøvene er holdbare i flere dager. På grunn av disse
vilkårene, brukes materialet fra SST glassene når prøvene skal sendes fra
primærhelsetjenesten og fra andre sykehus til UNN.
Ulempen med SST glass er den lange koagulasjonstiden. Noen rekvirenter eller avdelinger på
UNN, ønsker hurtig prøvesvar. For eksempel ved behandling av pasient, medisinering,
traumer og andre lignende situasjoner. På laboratoriet går disse analysene under definisjonen
øyeblikkelig hjelp (Ø-hjelp).
2.3.2 BD Vacutainer Rapid Serum Tube (RST) Thrombin:
Prøverørene BD Vacutainer Rapid Serum Tube (RST) er navngitt som hurtigkoagulerende
eller trombinrør på laboratoriemedisin på UNN. RST glassene blir brukt ved Ø-hjelp. I tillegg
brukes disse prøveglassene på utvalgte avdelinger på sykehuset, blant annet akutten,
observasjonsposten, intensiv- og medisinsk intensiv avdeling (MIA).
!
6!
Fordelen med RST glassene er at de kan sentrifugeres etter bare 5 minutter. De sentrifugeres i
10 minutter med en hastighet på 1800 g. (12) Dette kommer av at veggen i glassene er dekket
med trombin. Trombin er en protease, som er den aktive formen til protrombin. I
koagulasjonskaskaden er trombin det siste leddet, og spalter frinogen til fibrin, som igjen
koagulerer blodet. Koagulasjonsfaktorene V, VIII, XI, XIII og blodplatene blir aktivert av
trombin. Dette er med på å fremme koagulasjonen.. (13)
RST glassene inneholde også gel, som gjør at blodlegemene og serum skilles. Vakuumet gjør
at riktig blodvolum blir fylt i glassene ved prøvetakning. Disse glassene finnes bare i en
størrelse på UNN, med et volum på 5 ml. (12)
Figur 6: Bildet viser SST og RST glass. SST glass har gul kork, mens RST glass har orange kork. Eget bilde.
2.4 Analytter:
2.4.1 Insulin:
Insulin er et peptidhormon som produseres i β-cellene i de langerhanske øyene i pankreas.
Hormonets oppgave er å regulere opptak av glukose til cellene. Glukose er en av kroppens
energikilder og blir lagret i leveren, som glykogen. De insulinproduserende cellene blir
stimulert til utskillelse, dersom glukosekonsentrasjonen i blodet øker. Når det er mangel på
glukose hemmes insulinutskillelsen. Etter et hvert måltid trer glukosesyklusen i kraft, deretter
etterfølges insulinsyklusen. Denne starter ca. 2 minutt etterpå. (14)
!
7!
I tillegg til å regulere opptaket av glukose til cellene er insulin med på å øke proteinsyntesen,
fettsyntesen og glykogensyntesen i leveren, muskulatur og fettvev.
På samme tid, hemmer insulin ketogenesen, glukoneogenese, lipolysen og proteolysen. (14)
Indikasjon: (14)
•
Hypoglykemi
•
Mistanke om insulinom
•
Diabetes mellitus (type 1 og type 2)
Referanseområdet på UNN for insulin: (15)
18-173 pmol/l
Referanseområdet for insulin er verken kjønns eller alders relatert, men krever at prøven er
tatt fastende.
Feilkilder: Eventuelle feilkilder som kan påvirke analysesvaret er heomlyse, insulin
antistoffer og store konsentrasjoner av proinsulin i blod. Insulin er en ustabil analytt på grunn
av kort halveringstid. I tillegg se pakningsvedlegg. (4, 14)
2.4.2 C-peptid:
C-pepetid blir i likhet med insulin produsert og regulert av β-cellene i pankreas. Peptidet er en
del av molekylet proinsulinet som består av insulin og c-peptid. På laboratoriet analyseres Cpeptid som mål for insulinproduksjonen. Insulin og C-peptid utskilles i like mengder til
blodbanen, men på grunn av insulinets korte halveringstid, fortrekkes C-peptid. C-peptid har
en halveringstid på ca. 35 minutter, mot insulin som bare har 3-5 minutter, og er derfor en
bedre analytt for diagnostisering. (14)
Indikasjoner: (14)
!
•
Mistanke om nedsatt insulinproduksjon eller insulinfølsomhet
•
Antistoffer mot insulin
•
Kontroll etter operasjon for pankreaskreft
•
Pankreatitt
•
Nyresvikt
•
Diabetes mellitus type 1 og type 2
•
Addisons sykdom
8!
Referanseområdet på UNN for C-peptid: (15)
370-1470 pmol/L
Referanseområdet krever at prøven er tatt fastende.
Feilkilder: Se pakningsvedlegg (3)
2.4.3 Fritt T3:
Trijodthyronin (T3) produseres i folliklene i thyreoidea, sammen med tyroksin (T4). De to
hormonene kontrollerer og stabiliserer stoffskiftet i kroppen. Det kardiovaskulære systemet,
vekst- og beinmetabolismen og utviklingen av kjønnskjertlene og nervesystemet er avhengig
av at stoffskifte fungerer optimalt. (14)
Utskillelsen av thyreoideahormonene reguleres metabolsk og skjer igjennom stimulering av
thyreoideastimulerendehormon (TSH). 0,3 % av T3 er i fri form (FT3), resterende er bundet
til tyroksinbinende globulin (TBG) eller albumin. FT3 er den aktive formen. Det virker
direkte på målorganet og gir rask respons, mens T4 omdannes til T3 i perifert organ for å
kunne utføre sin funksjon. Responsen fra T4 skjer derfor saktere. På laboratoriet analyseres
FT3 sammen med TSH og Fritt T4 (FT4). (14)
Indikasjoner: (14)
•
Hypertyrose
•
Hypotyrose
•
Sykdommer hypofysen
•
Kontroll ved behandling med liotyronin
Referanseområder på UNN for FT3: (15)
2,8-7,1 pmol/L
Referanseområdet er ikke alder eller kjønnsrelatert.
Feilkilder: Eventuelle feilkilder som kan påvirke analysesvaret er auto antistoffer mot T3,
abnorme bondeproteiner eller farmaka. I tillegg se pakningsvedlegg. (1, 14)
!
9!
2.4.5 NT ProBNP:
Brain neuretic peptid (ProBNP) produseres i hjertemuskulaturen. Peptidet blir utskilt fra
hjerteventrikkelen til blodbanen ved påvirkning av hjerte, for eksempel ved hjertestrekk eller
andre kardiovaskulære forstyrrelser. (16)
Under prosessen spaltes proBNP til aktivt BNP og det N-terminale fragmentet NT-proBNP.
Dette gir en hemmende effekt på renin-angiotensinsystemet, fører til økt utskillelse av
natrium i urin og utvidelse av blodåreveggen. ProBNP er et stabilt forstadiet av BNP, og blir
derfor brukt i analysen på laboratoriet. (16)
Indikasjon: (16)
•
Diagnostikk av hjertesvikt
•
Oppfølging av behandlingseffekt
•
Utelukker falsk-positive hjertesvikter
Referanseområdet på UNN for NT proBNP: (15)
Kvinner < 50 år: < 170 ρg/ml
Kvinner 50 - 70 år: < 250 ρg/ml
Kvinner 70 - 80 år: < 500 ρg/ml
Kvinner > 80 år: < 1700 ρg/ml
Menn < 50 år: < 85 ρg/ml
Menn 50 - 70 år: < 170 ρg/ml
Menn 70 - 80 år: < 500 ρg/ml
Menn > 80 år: < 850 ρg/ml
Referanseområdet er kjønns og alders relatert. BNP analysen er ikke standardisert, som fører
til at referanseområdet er avhengig av utstyr, metode og laboratoriet. Selve NT-proBNP er
standardisert og har felles referansematerialet. Utstyr og metode har dermed ikke påvirkning
på analysesvaret. (16)
Feilkilder: Enkelte diuretika-behandlinger kan påvirke peptidkonsentrasjonen. I tillegg se
pakningsvedlegg. (2, 16)
!
10!
2.5 Forsøk:
2.5.1 Holdbarhet:
Når holdbarheten for en analytt skal undersøkes, er det ønskelig at alle konsentrasjonsnivå er
dekket; lave, høye og normale områder. Tidligere studier ved UNN har det i midlertid vist seg
at det er unødvendig å dekke alle nivåene. På grunnlag av dette er det mest relevant å bruke
prøver fra referanseområdet.
2.5.2 Verifisering:
Verifisering på laboratoriet går ut på å sammenligne metoder, prøvemateriale, utstyr eller
instrumenter. I dette tilfellet skulle vi sammenligne prøvesvar for SST og RST glass. I mange
sammenhenger blir det tatt RST glass av pasienter, for ønske om raskere prøvesvar. For
eksempel ved innkomst i akutten, eller ulike avdelinger på UNN. Prøvene blir da rekvirert
som Ø-hjelps prøver. Vi skal derfor undersøke at de to prøveglassene gir samme prøvesvar og
kan brukes om hverandre i rutinen.
I verifiseringsstudier er det essensielt å få målt lave, normale og høye konsentrasjonsområder
for å sikre alle nivåer. Dette kan oppnås med å bruke prøvemateriale fra friske og syke
personer. Det er også viktig at studiet dekker flere aldersgrupper og er kjønnsfordelt. Ved
prøvetaksenheten på UNN, kommer det både inneliggende og tilreisende pasienter for
prøvetakning. Dette omfatter både frisk og syke, kvinner og menn, og alle aldre. For at
verifiseringen skal være optimal må det tas minimum 20 prøveglass.
2.6 Feilkilder:
Fra en prøve blir rekvirert til svaret foreligger i pasientjournalen, er det mange feilkilder som
kan oppstå. Feilkildene blir delt inn i tre grupper: preanalytisk, analytisk og postanalytisk.
Laboratoriet har gode prosedyrer, retningslinjer og ulike dokumenter for at prøvesvar skal
oppnå best mulig kvalitet og sikkerhet. Vedlikehold av instrumentene og god opplæring av de
ansatte, er med på å redusere feilkildene.
2.6.1 Preanalytiske feilkilder:
Alle feilkilder som kan oppstå fra en prøve rekvireres til den settes i analyseinstrumentet, blir
definert som preanalytiske feilkilder. Disse utgjør den største prosentdelen av de nevnte
inndelingene. Feilen kan foreligge hos pasient, rekvirent, prøvetaker/behandler eller utstyr.
!
11!
Enkelte analyser krever at pasienten er fastende eller oppfyller andre satte krav før
prøvetakning. Dersom pasienten ikke oppfyller de gitte krav, kan dette være med på å påvirke
analysesvaret. Et stort ansvar ligger hos prøvetaker, som har ansvaret for at riktige prøveglass
blir tatt til de riktige analysene. Ulike analyser krever ulikt prøvematerialet. I tillegg er
glassrekkefølgen betydningsfull for analysen. Dette på grunn av at de ulike glassene
inneholder forskjellige tilsetningsstoffer. Etter at prøvene er tatt, må glassene vendes 5-6
ganger for å få prøven homogen og blandet med tilsetningsstoffene.
Prøvetaker må også forsikre seg om at prøve blir tatt av rett pasient, med å spørre etter fult
navn, samt fødsels- og personnummer. Under prøvetakning bør ikke stasebruket overdrives.
Ved lang stase kan det intracellulære miljø og koagulasjonsfaktorer påvirkes, som igjen kan
påvirke analysesvaret.
De ulike glassene oppbevares forskjellig etter prøvetakning og før sentrefungering. Riktige
betingelser er essensielle for analysesvaret. Dersom prøven sentrifugeres for tidlig kan det
oppstå fibrin eller eventuelt hemolyse. Prøveglassene bør sentrifugeres innen 2 timer etter
prøvetakning, for å unngå at komponenter lekker ut av erytrocyttene eller at blodcellene
lyserer. Det finnes egne prosedyrer og vilkår for håndtering og sentrifugering til hver type
glass.
2.6.2 Analytiske feilkilder:
Analytiske feilkilder er de som oppstår i instrumentet. I flere pakningsvedlegg til analysene,
settes det krav til at prøvematerialet, reagens og kontroller har romtemperatur. Det er også
viktig at det ikke befinner seg bobler eller forurensninger. Mange instrumenter er i dag
automatisert og utstyrt med varslingssystem. Feil på instrument eller behandling oppdages
gjennom varslingssystemet, og feil i analysen blir derfor minimalisert.
For å få best mulig kvalitet på analysene benyttes kalibreringer og kvalitetskontroller.
Gjennom kvalitetskontroller sikres det for analytiske feil. Analytiske feil deles inn i tilfeldigeog systematiske feil. De tilfeldige feilene kan ikke elimineres, men holdes minimale ved
oppfylling av gitte krav. Verdien ligger omentrent rundt sann verdi. Mens de systematiske
feilene kan variere, og ofte ligger de høyt eller lavt i forhold til sannverdi. Systematiske feil
!
12!
kan elimineres og skyldes menneskelige, instrumentelle, feil på selve analysen eller en
kombinasjon av disse.
For hver analytt finnes det en analytisk usikkerhet. Denne blir beregnet og tatt hensyn til opp
mot prøvesvaret. Noen analytter påvirkes av interferens (hemolyse, lipemi eller ikterus), som
påvirker analysesvaret. Det er satt opp grenser for hva som er akseptabelt. Overstiger disse,
forkastes analysen.
2.6.3 Postanalytiske feilkilder:
Postanalytiske feilkilder er de som oppstår etter at prøven er analysert og til prøvesvaret
foreligger hos rekvirent. De forkommer når prøvebehandler skal tolke, vurdere og frigi
prøvesvar. I mange tilfeller varsler instrumentet at analysesvaret ikke kan frigis. For eksempel
interferens i prøvematerialet eller dersom prøvesvaret er svært forhøyet i forhold til
referanseområdet. Hvordan prøvesvar tolkes og vurderes er avgjørende.
Etter at analyseinstrumentene ble automatisert, har de postanalytiske feilkildene blitt
minimert. Dette kommer av at prøvesvaret sendes til rekvirent elektronisk. Større usikkerhet
foreligger når prøvesvar gis muntlig eller skriftlig.
2.6.4 Biologisk variasjon:
Biologisk variasjon omhandler naturlige og fysiologiske variasjoner av metabolitter i ulike
kroppsvæsker i et individ. Den biologiske variasjonen deles inn i intra- (CVw) og Interindividuell (CVb) variasjon. CVw er variasjon som oppstår hos hvert enkelt individ, med tanke
på alder, kjønn, genetiske faktorer og graviditet. Mens CVb omhandler variasjon mellom
individer i form av; aktivitet, kosthold, vekt, medikamenter og prøvetakning. (17)
Hver analytt har egen prosentverdi for biologisk variasjon, som er satt med hensyn på
referansegrensene som skiller de ”syke” fra de friske. Summen av CVw og CVb gir den totale
biologiske variasjonen (CVTB). Den defineres ut fra formelen:
!"!" =
!
!"!! + !"!!
13!
Når et analysesvar skal vurderes, må både den biologiske og analytiske variasjonen bli tatt
hensyn til. Med tanke på tillatte avvik deles variasjonen inn i optimal, ønskelig og minimums
krav. (17)
Optimal: B < 0,125 * CVTB
Ønskelig: B < 0,25 * CVTB
Minimum: B < 0,375 * CVTB
For å beregne øvre og nedre grense, for de tre typene tillatte avvik brukes formelen:
Middelverdi til fasit ± ((Middelverdi til fasit *type tillatt avvik)/100 %)
3.0 Material og metode:
Modular E602 analyserer analyttene Insulin, C-peptid og FT3 med sandwichprinsippet og
anlytten NT proBNP med kompetitivt prinsippet.
3.1 Biologisk variasjon:
Tabell 1: Oversikt over analyttenes biologisk variasjon (18)
Analytt
Biologisk variasjon %
CVw
CVb
-s
Insulin
21,1
58,3
-s
C-peptid
16,6
23,2
-s
FT3
7,9
17,6
-s
NT ProBNP
10
16
Total biologisk variasjon:
Insulin: 21,12! ! + ! 58,32! = 62,00 %
C-peptid: 16,62! ! + ! 23,22! = 28,53 %
FT3: 7,92!! + ! 17,62! = 19,30 %
ProBNP: 10,02! ! + ! 16,02! = 18,87 %
!
14!
Mål for systematisk feil/tillatt avvik/bias:
Insulin:
Optimal: B < 0,125 * 62,00 = 7,75 %
Ønskelig: B < 0,25 * 62,00 = 15,5 %
Minimum: B < 0,375 * 62,00 = 23,25 %
C-peptid:
Optimal: B < 0,125 * 28,53 = 3,57 %
Ønskelig: B < 0,25 * 28,53 = 7,14 %
Minimun: B < 0,375 * 28,53 = 10,70 %
FT3:
Optimal: B < 0,125 * 19,30 = 2,41 %
Ønskelig: B < 0,25 * 19,30 = 4,83 %
Minimun: B < 0,375 * 19,30 = 7,24 %
ProBNP:
Optimal: B < 0,125 * 18,87 = 2,36 %
Ønskelig: B < 0,25 * 18,87 = 4,72 %
Minimun: B < 0,375 * 18,87 = 7,08 %
3.2 Kontroller, reagens og utstyr:
I dette studiet har vi brukt kontrollene som brukes i rutinen for analyttene. For insulin og Cpeptid brukes Seronorm immunoassay 1 (SN1) som kontroll. FT3 har SN2 som kontroll,
mens NT proBNP har både SN1 og SN2 som kontroll. I tillegg til de nevnte kontrollene er det
brukt en intern kvalitetskontroll, donor, som UNN selv har produsert. Donorkontrollene er
serum fra blodgivere, som er virusklarert ved mikrobiologen. Den interne kontrollen har
kjente verdier og er lik pasientprøve, og egner seg godt som kontroll. De oppbevares i fryser i
-70°C i eppendorf-rør, opp til 3 år.
!
15!
For å korrigerer for drift analyserte vi i tillegg donorkontrollene sammen med
prøvematerialet. Hver dag ble det tatt opp nye donorkontroller som ble fordelt i fem hitatchi
kopper. På samme måte som prøvematerialet, ble donorkontrollene registrert og analysert som
ukjente prøver.
Tabell 2: Lot-nummer på kontroller vi har brukt i vårt studie:
SN1: 1108449
SN2: 1108450
Donor:
Donor 13
Insulin
*
C-peptid
*
FT3
*
NT proBNP
*
*
Tabell 3: Lot-nummer på reagenser vi har brukt i vårt studie:
Insulin
C-peptid
FT3
LOT:
172706
175758
177312
*
*
*
*
NT ProBNP
173210/175150
Tabell 4: Lot-nummer på kalibratorer vi har brukt i vårt studie:
Insulin
C-peptid
FT3
NT ProBNP
LOT:
172152
172038
173884
172615
Tabell 5: Lot-nummer og holdbarhet på SST og RST glassene vi har brukt i vårt studie:
SST glass
RST glass
LOT:
3329493 (2015-05)
131112 (2015-01)
Kontroll og reagens er kjøpt fra firmaet Roche. Prøveglassene er kjøpt av firmaet Puls-norge.
3.3 Fremgangsmåte:
Både holdbarhetsstudiet og verifisering ble analysert på cobas 8000 E602. De to studiene har
ulike fremgangsmåte og blir beskrevet hver for seg. Analyttene insulin, FT3 og c-peptid ble
gjort på begge studiene, mens analytten NT proBNP bare var med i holdbarhetsstudiet.
3.3.1 Holdbarhet:
Siden det er mest relevant å gjennomføre et holdbarhetsstudie med prøver i referanseområdet,
ble vi sammen med veileder enig om å bruke en frivillig som oppfylte dette kravet. Resultatet
fra denne delen av forsøket ble ikke dokumentert.
Holdbarhetsforsøket gikk ut på å undersøke holdbarheten for fire analytter; insulin, C-peptid,
FT3 og NT proBNP , i SST- og RST glass. Det ble tatt 10 prøveglass av den frivillig; 5 SST
glass og 5 RST glass.
!
16!
I SST glassene ble holdbarheten for proBNP undersøkt. I pakningsvedlegget for analytten blir
det opplyst at den har en holdbarhet på 6 dager. SST glassene ble derfor analysert på dag 0, 6
og 7. I RST glassene ble holdbarheten for alle de fire analyttene undersøkt. Det har ikke blitt
utført holdbarhetsstudier på RST glassene tidligere. RST glassene ble derfor analysert fra dag
0 til dag 7. I tillegg ble det hver dag analysert donorkontroller.
Tabell 6: Oversikt over analyseringen som ble gjort hver dag.
DAG:
0
1
2
3
4
5
6
7
SST
RST
Donor
(proBNP)
(Insulin, c-peptid, FT3 og
proBNP)
(insulin, c-peptid, FT3 og NT
proBNP)
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Etter at prøvene var tatt av den frivillige ble SST glassene stående i romtemperatur i 30
minutter før de ble sentrifugert, mens RST glassene ble sentrifugert etter 5 minutter. Etter
sentrifugering ble prøveglassene satt direkte i analyseinstrumentet. Hvert prøveglass fikk eget
ID-merke, som ble lagt inn manuelt i datasystemet. Dette for å skille prøveglassene og dagene
fra hverandre. I tillegg ble parallellene skilt fra hverandre med ulike nummer. RST glassene
ble merket med bokstaven H for hurtigkoagulerende, og tallet til den tilhørende dagen
analyseringen fant sted. For eksempel H1-1. Dette tilsvarer RST glass dag 1, parallell 1. På
samme måte ble SST glassene identifisert med bokstaven V, for vanlig serum med gel og
donorkontrollen med bokstaven D, med samme tallkode system. Etter analysering ble
prøveglassene satt i kjøleskap 2-8 °C, til neste dag.
Etter instruksene fra pakningsvedleggene til de ulike analyttene ble prøvematerialet tatt ut av
kjøleskap og satt på benk til de fikk romtemperatur før de ble analysert, de resterende dagene.
3.3.2 Verifisering:
I verifiseringsforsøket skal vi sammenligne kvaliteten på analysesvaret for RST glassene opp
mot SST glassene, med analyttene; insulin, c-peptid og fritt T3. Vi tok til sammen 50
prøveglass; 25 SST glass og 25 RST glass, av polikliniske pasienter. For å oppnå variert
aldersgruppe og kjønnsfordeling, prøvde vi å ta et bestemt utvalg av pasienter. Det ble tatt et
!
17!
SST glass og et RST glass av hver pasient. De 50 prøveglassene som ble innsamlet ble merket
anonymet med egne lab-nummer med strekkode, hver pasient fikk eget tall. De er derfor ikke
sporbare og blir ikke koblet opp mot datasystemet til UNN. For at analyseinstrumentet skulle
klare å lese barkodene var det nødvendig med 12 siffer. SST glassene ble merket med
6001000- og RST glassene ble merket med 7001000-. Eksempel 60010007 og 70010007.
Etter at prøvene ble tatt og merket, ble de sentrifugert. RST glassene ble sentrifugert etter ca.
5 minutter, mens SST glassene sentrifugert etter ca. 30 minutter. Deretter ble alle
prøveglassene satt i kjøleskap til neste dag. Før analyseringen ble prøveglassene tatt ut av
kjøleskap for å få romtemperatur. Deretter ble de satt direkte i instrumentet som registrerte
barkodene som var knyttet til hver prøve. Prøvene ble analysert 2 ganger, for å oppnå
paralleller.
3.4 NKK regneark:
Norsk klinisk-kjemisk kvalitetssikring (NKK) er en organisasjon som jobber med å utvikle
kvalitetsvurderingsprogram til norske laboratorier. Kvalitetsprogrammene er basert på
metodevalidering og kontroll av målemetoder.
Laboratoriet på UNN bruker blant annet NKK sine regneark for vurdering av holdbarhet og
verifisering. (19)
I vårt holdbarhetsstudiet valgte vi å bruke NKK sitt regneark ”To metoder for testing av
stabilitet av prøvematerialet”. Mens for verifiseringsstudiet valgte vi å bruke dataprogrammet
excel.
!
!
18!
4.0 Resultater:
4.1 Kontroller:
Resultatene fra kontrollene blir representert i shewhart diagrammer under. Shewhart er basert
på westgardreglene. Hvert diagram er satt opp med tid på x-aksen og resultater på y-aksen.
Det hvite området i diagrammene utgjør ± 2 standardavvik (SD), ut fra fasitverdi. En av
reglene til westgard er blant annet at resultatene skal ligge innenfor ± 2 SD. (17) Resultatene
er vist i koloner, fra dag til dag.
Hver dag sjekket vi at kontrollene var innenfor de godkjente grensene.
Figur 7: Utskrift fra datasystemet QM av kvalitetskontroll for insulin i analyseperioden.
Som vist på figur 7 er kontrollverdiene for insulin jevnt fordelt rundt fasitverdi og er innenfor
de akseptable grensene.
!
19!
Figur 8: Utskrift fra datasystemet QM av kvalitetskontroll for C-peptid i analyseperioden.
Som vist på figur 8 er kontrollverdiene for C-peptid jevnt fordelt over fasitverdi og er
innenfor de akseptable grensene.
Figur 9: Utskrift fra datasystemet QM av kvalitetskontroll for NT proBNP i analyseperioden.
!
20!
Som vist på figur 9 er SN1 og SN2 for NT proBNP innenfor de akseptable grensene. I tillegg
viser diagrammet for SN1 at det har vært et LOT-skifte 6 dag i analyseringen. Et LOT-skifte
vil ikke påvirke prøvesvaret, på grunn av prøvesvaret korrigeres etter kontrollene.
Figur 10: Utskift fra datasystemet KIMS av kvalitetskontroll for FT3 III i analyseperioden.
Den nye versjonen FT3 III er ikke enda lagt inn i QM på laboratoriet. Vi har derfor tatt utskift
av verdimålingene i analyseperioden. Figur 10 viser at FT3 III er innenfor de akseptable
grensene.
!
21!
4.2 Holdbarhetsforsøk:
Tabell 7: Gjennomsnitt av analyseverdiene av SST glassene fra dag 0 til 7.
Prøve
Insulin
C-peptid
FT3 III
ProBNP
ProBNP
RST
RST
RST
SST
RST
pmol/L
pmol/L
pmol/L
pg/ml
pg/ml
Dag 0
20,54
485,78
4,33
19,77
19,78
Dag 1
20,33
479,78
4,27
19,86
Dag 2
20,45
480,28
4,33
19,41
Dag 3
20,30
472,82
4,41
19,65
Dag 4
20,40
464,58
4,36
20,43
Dag 5
20,27
464,50
4,51
19,97
Dag 6
19,76
454,42
4,39
18,91
18,90
Dag 7
20,05
453,70
4,44
20,22
20,85
Tabell 8: Gjennomsnitt av donorkontrollen fra dag 0 til 7, for hver analyse.
Donor
Insulin
C-peptid
FT3 III
ProBNP
pmol/l
pmol/l
pmol/l
pg/ml
Dag 0
178,70
1298,80
4,71
60,76
Dag 1
178,28
1288,80
4,66
61,24
Dag 2
181,62
1299,80
4,70
61,09
Dag 3
178,68
1285,80
4,63
59,77
Dag 4
181,50
1282,40
4,75
61,04
Dag 5
179,04
1308,40
4,83
62,24
Dag 6
179,28
1270,40
4,59
60,39
Dag 7
172,78
1270,60
4,70
65,40
Ut fra tabellene over, ble det laget diagram for hver analytt i de ulike glassene. Diagrammene
viser endring i prosent fra dag 0 til dag 7, for konsentrasjon for de ulike analyttene. Det er
beregnet konfidensintervall (KI) ut fra analyttenes biologiske variasjon. Vi benyttet et KIintervall på 90 %. Disse er markert som små blå streker over og under prøveverdien i figurene
for holdbarhet. Grensene som er beregnet er basert på optimale og ønskelige tillatte avvik. De
presenteres som mål 1 og mål 2 i grafene. Dersom hele KI for en analytt ligger utenfor tillatte
avvik, definerer UNN at holdbarheten for analytten ikke er godkjent. Verdiene som er målt er
korrigert for donorkontroll hver dag, for å unngå drift.
!
22!
Figur 11: Endring i prosent fra dag til dag, av insulin konsentrasjonen i RST glass.
Figur 12: Endring i prosent fra dag til dag av C-peptid konsentrasjonen i RST glass.
Figur 13: Endring i prosent fra dag til dag, av FT3 konsentrasjonen i RST glass.
!
23!
Figur 14: Endring i prosent fra dag 6 og 7 av NT proBNP konsentrasjon i SST glass.
Figur 15: Ending i prosent fra dag til dag, av NT proBNP konsentrasjon i RST glass.
Som vist på figurene for holdbarhet, ligger hver analytt innenfor de optimale kravene for
tillatte avvik i 7 dager.
!
24!
4.3Verifisering:
Differansediagram!Insulin!
SSTARST!(pmol/L)!
130,0!
80,0!
30,0!
-20,0!0,00#
150,00#
300,00#
450,00#
600,00#
750,00#
-70,0!
-120,0!
Gjennomsnitt!Insulin!(pmol/L)!
Figur 16: Differansediagram for insulin
Differansediagrammet presenterer differansen mellom SST glassene og RST glassene på Yaksen, og middelverdiene av begge glassene på X-aksen for insulin konsentrasjonen.
Vi har fire prøver som ikke er innenfor optimal tillatte avvik, se vedlegg nr.1. Ønskelig tillatte
avvik for insulin er derfor beregnet:
Prøve nr.2: 656,27 – 897,03 pmol/l
Prøve nr. 10: 291,65- 398,65 pmol/l
Prøve nr. 17: 291,02 – 397,78 pmol/l
Prøve nr. 18: 43,45 – 59, 38 pmol/l
Prøve nr. 10 er ikke innenfor ønskelig tillatte avvik. Minimum tillatte avvik for insulin er
derfor beregnet:
Prøve nr. 10: 264,90 – 419,05 pmol/l
!
25!
Differansediagram!CApeptid!
300!
SSTARST!(pmol/L)!
250!
200!
150!
100!
50!
0!
800#
-50!
1800#
-100!
2800#
3800#
4800#
5800#
Gjennomsnitt!CApeptid!(pmol/L)!
Figur 17: Differansediagram for C-peptid.
Differansediagrammet presenterer differansen mellom SST glassene og RST glassene på Yaksen, og middelverdiene av begge glassene på X-aksen for C-peptid konsentrasjonen.
Vi har fire prøver som ikke er innenfor optimal tillatte avvik, se vedlegg nr. 2. Ønskelig
tillatte avvik for C-peptid er derfor beregnet:
Prøve nr.5: 861,83 – 994,37 pmol/l
Prøve nr. 10: 2212,85 – 2553,15 pmol/l
Prøve nr. 17: 1874,38 – 2162,62 pmol/l
Prøve nr. 22: 1038,17 – 1197,83 pmol/l
Prøve nr. 10 er ikke innenfor ønskelig tillatte avvik. Minimum tillatte avvik for C-peptid er
derfor beregnet:
Prøve nr. 10: 2128,02 – 2637,98 pmol/l
!
26!
SSTARST!(pmol/L)!
Differansediagram!FT3!
0,3!
0,25!
0,2!
0,15!
0,1!
0,05!
0!
-0,05! 3,4#
-0,1!
-0,15!
-0,2!
3,9#
4,4#
4,9#
5,4#
5,9#
6,4#
Gjennomsnitt!FT3!III!(pmol/L)!
Figur 18: Differansediagram for FT3
Differansediagrammet presenterer differansen mellom SST glassene og RST glassene på Yaksen, og middelverdiene av begge glassene på X-aksen for FT3 III konsentrasjonen.
Vi har fire prøver som ikke er innenfor optimal tillatte avvik, se vedlegg nr. 3. Ønskelig
tillatte avvik for FT3 er derfor beregnet:
Prøve nr.4: 4,59 – 5,06 pmol/l
Prøve nr. 17: 5,09 – 5,60 pmol/l
Prøve nr. 20: 3,63 – 4,00 pmol/l
Prøve nr. 25: 5,78 – 6,36 pmol/l
!
!
!
!
27!
5.0 Diskusjon:
5.1 Holdbarhet:
Prøvene som ble tatt til holdbarhetsstudiet, behandlet vi etter standard prosedyre, som
omhandler prøvetakning, koagulasjonstid, sentrifugering og oppbevaring. Som illustrert i
tabell 6, ble SST glassene analysert dag 0, 6 og 7, mens RST glassene ble analysert hver dag.
I tillegg ble nye donorkontroller tatt opp fra fryseren hver dag. Laboratoriet ønsket at vi skulle
gjennomføre studiet, på lik måte som prøvene blir behandlet i rutinen. Dette med tanke på
hvordan prøvematerialet blir påvirket av ulike omstendigheter.
Før analysering ble prøveglassene tatt ut av kjøleskap og satt på benk til de hadde tilnærmet
romtemperatur, ca. 20-30 minutter. På samme måte behandlet vi donorkontrollene. Rett før de
skulle analyseres, ble prøvene av-korket og satt i instrumentet. Vi opplevde blant annet at
prøven av og til ble stående på ”vent”, og at noen ikke ble analysert på grunn av clott-alarm.
Vi måtte derfor gjøre analyseringen på nytt. Noen ganger ble prøvene stående en stund, før de
ble korket og satt inn i kjøleskap. Dette kan føre til fordampning av prøvematerialet, som kan
påvirke prøvesvaret og igjen holdbarheten. Men dette er hendelser som oppstår på laboratoriet
hver dag.
5.1.1 Insulin:
Som vist på figur 11 ser vi at holdbarheten for insulin forholder seg relativt stabil i 7 dager.
De aksepterte grensene for analytten er innenfor de optimale tillatte avvik. I tabell 8, ser vi at
donorkontrollene også holder seg stabil gjennom studiet.
5.1.2 C-peptid:
Som vist i figur 12 ser vi at holdbarheten for C-peptid gradvis synker, men jevnes ut og holder
seg relativt stabil fra dag 5 til 7. De aksepterte grensene for analytten er innenfor de optimale
tillatte avvik. I tabell 7 og 8 for C-peptid, ser vi at verdiene på donorkontrollene holder seg
stabil i alle dagene, bortsett fra dag 5. Her skjer det en økning i donorkontrollen, som
medfører at holdbarheten nesten er utenfor de optimale kravene.
5.1.3 FT3 III:
Som vist på figur 13 ser vi at holdbarheten for FT3 III er jevn bortsett fra dag 3 og 6, der det
skjer et ”hopp” i grafen. I tabell 7 og 8, ser vi at donorkontrollen synker mens prøveverdien
øker på dag 3. På samme måte ser vi at donorkontrollen synker veldig, mens prøveverdien
holder seg stabil på dag 6. Men de aksepterte grensene for analytten er fremdeles innenfor de
optimale tillatte avvik.
!
28!
5.1.4 NT proBNP:
Som vist på figur 14 ser vi at holdbarheten for NT proBNP i SST glass synker etter dag 6 til
dag 7. Hvordan verdiene varierer mellom dag 0 til 5, er uvisst. De aksepterte grensene for
analytten er innenfor de optimale tillatte avvikene. I tabell 7 og 8 ser vi at donorkontrollen og
prøveverdien får en stor økning, som medfører at de aksepterte grensene så vidt er innenfor de
optimale tillatte avvik.
Som vist på figur 15 ser vi at holdbarheten for NT proBNP i RST glass er jevn, men
varierende i 7 dager. På dag 2 faller grafen, før den stiger på dag 4, og igjen synker på dag 6. I
tabell 7 og 8 ser vi at verdiene for donorkontrollene holder seg stabil, mens prøveverdiene
synker dag 2 og 6, og øker dag 4. Men de aksepterte grensene for analytten er fremdeles
innenfor de optimale tillatte avvikene.
LOT-skiftet har ikke påvirket resultatene siden prøvesvaret er korrigert etter kontrollene.
5.2 Verifisering:
I verifiseringsstudiet har vi undersøkt om RST glassene gir samme prøvesvar som for SST
glassene på 3 ulike analytter, og dersom eventuelle forskjeller kan ha klinisk betydning.
Under innsamling og behandling av prøvemateriale ble standard prosedyre fulgt. Som
omhandler prøvetakning, koagulasjonstid, sentrifugering og oppbevaring for de ulike
glassene.
Vårt mål var å innsamle prøver fra de ulike konsentrasjonsområdene, for å se om høye,
normale og lave verdier ga samme prøvesvar. I dette studie ble tilfeldige personer valgt, der
det var uvisst om de var friske eller syke, eller om de gikk på noen medikamenter. Vi fikk et
spredt konsentrasjonsområde for insulin og C-peptid, mens for FT3 fikk vi bare verdier i
normalområdet. Lave og høye konsentrasjoner av FT3 er vanskelig å oppnå med polikliniske
prøver. Dersom vi skulle fått et spredt konsentrasjonsområde måtte vi valgt ut bestemte
inneliggende pasienter, noen som er et svært krevende arbeid. Sammen med veileder bestemte
vi oss derfor å bruke de dataene vi allerede hadde.
For å sammenligne glassene mot hverandre, ble middelverdiene for parallellene og
differansen mellom middelverdiene beregnet. Deretter satt vi optimal nedre og øvre grense for
hver analytt. Disse grensene ble bestemt ut fra middelverdien til SST glassene som vi antok
som fasit verdi.
!
29!
5.2.1 Insulin:
Som vi ser på figur 16 er differansen på prøveverdiene mellom SST og RST glassene nesten
lik null. Dette betyr at prøveglassene gir tilnærmet likt prøvesvar. Men samtidig er det 2
punker som avviker, der prøveglassene gir stor forskjell i prøvesvaret.
I vedlegg 1 ser vi at det er 4 prøver som utenfor de optimale grensene. Prøve nr. 2, 17 og 18
gir en middelverdi for RST glassene som er over den optimale øvre grensen. Og prøve nr. 10
gir en middelverdi for RST glasset som er under den optimale nedre grensen. Dersom vi setter
grensene til ønskelig tillatt avvik, vil prøve nr. 2, 17 og 18 ligge innenfor kravene. Prøve nr.
10 vil derimot ikke ligge innenfor de ønskelige eller minimale tillatte grensene.
Vi vurderte om høye eller lave konsentrasjonsområder kunne være årsak til avvikene. Men
når vi på alle prøvesvarene ligger både lave og høye verdier innenfor de optimale grensene.
Ser vi på parallellene for SST glasset til prøve nr. 2 er det stor forskjell, mens parallellene i
RST glass er lik. Forskjellen på parallellene i SST glassene kan være av analytisk årsak.
Samtidig ser vi at det er stor forskjell på prøvesvaret i de to glasstypene for prøve nr. 2, 10 og
17. Forskjellene kan komme av ulike årsaker. Kan det være noe i prøvematerialet som
reagerer med innholdet i glasstypene? Kan det ha noe med medikamenter, sykdom eller
lignende?
Ettersom vi har prøver som dekker alle konsentrasjonsområder, og som er innenfor optimale
og ønskelige grenser, velger vi å se bort i fra prøve nr. 10 når det gjelder verifisering av RST
glassene for hormonet insulin.
5.2.2 C-peptid:
Som vi ser på figur 17 er differansen mellom SST og RST glassene nesten lik null i
referanseområdet. Det er noen verdier som avviker i det høye konsentrasjonsområdet. I
vedlegge nr. 2 ser vi at det er 4 prøver som er utenfor den optimale grensen. Prøve nr. 5 og 17
har en middelverdi for RST glassene som er over den optimale øvre grensen. Prøve nr. 10 og
22 gir en middelverdi for RST glassene som er under den optimale nedre grensen. Dersom vi
setter grensen til det ønskelige tillatte avvik, vil både prøve nr. 5, 17 og 22 være innenfor
kravene. Prøve nr. 10 vil derimot ikke ligge innenfor de ønskelige eller minimale tillatte
grensene.
!
30!
I vedlegg 2 ser vi at resterende prøvesvar i lave og høye konsentrasjonsområdet er innenfor de
optimale grensene. Vi kan derfor utelukke at konsentrasjonsnivåene påvirker valg av
prøveglass. På prøve nr. 5 avviker parallellene fra hverandre i liten grad for SST glassene. På
samme måte avviker parallellene på prøve nr. 22 for RST glassene. Forskjellen på parallellene
kan være av analytiske årsaker. Forskjellen SST og RST glassene gir, i prøve nr. 5, 10, 17 og
22 kan være av ulike årsaker som allerede er nevnt.
Ettersom vi har prøver som dekker alle konsentrasjonsområder, og som er innenfor optimale
og ønskelige grenser, velger vi å se bort i fra prøve nr. 10 når det gjelder verifisering av RST
glassene for hormonet C-peptid.
5.2.3 FT3:
Som vi ser på figur 18 er differansen mellom SST og RST glassene omtrent lik null i
referanseområdet. I vedlegg nr. 3 ser vi at det er 4 prøver som er utenfor den optimale
grensen. Prøve nr. 4, 17, 20 og 25 har en middelverdi for RST glassene som er under den
optimale nedre grensen. Dersom vi setter grensen til det ønskelige tillatte avvik, vil alle de
nevnte prøvene være innenfor kravene.
I vedlegg 2 ser vi at alle prøveverdiene er i referanseområdet, og vi kan dermed ikke si om
lave eller høye konsentrasjonsområder vil påvirke prøvesvaret. FT3 har et smalt
referanseområdet på 2,8 til 7,1 pmol/l . Vi kan også se at det ikke er stor forskjell på alle
parallellene både for SST og RST glassene. De eventuelle forskjellene mellom glassene kan
komme av tilfeldige feil.
6.0 Konklusjon:
I vårt holdbarhetsstudie kan vi ut fra resultatene, konkludere med at analyttene insulin, Cpeptid, FT3 og NT proBNP har en holdbarhet i 7 dager i RST glass. I tillegg viser resultatene
for NT proBNP i SST glass at analytten har en holdbarhet i 7 dager.
I verifiseringsstudiet vi har gjennomført konkluderer vi at RST glass gir optimale kvalitet,
sammenlignet med SST glass, ut fra resultatene. Vi velger å forkaste resultatene for prøve nr.
10 siden verdiene for insulin og C-peptid ikke er innenfor minimumskravet og på grunn av
usikkerheten som ligger bak prøvematerialet. Samtidig er alle konsentrasjonsnivåer dekket og
er innenfor optimal eller ønskelig tillatte avvik.
!
31!
Kilder:!!
1. Roche.com FT3 III http://tinyurl.com/obyrkp6 (27.05.2014)
2. Roche.com ProBNP http://tinyurl.com/ohmxbau (27.05.2014)
3. Roche.com C-peptid http://tinyurl.com/q6evdk4 (27.05.2014)
4. Roche.com Insulin http://tinyurl.com/ox8z6ce (27.05.2014)
5. Roche.com http://tinyurl.com/oe3xexr (20.05.2014)
6. Cobas 8000 modular analyzer series: Operator`s Manual, Software Version 02, 20092010
7. SMNL http://tinyurl.com/ns77yks (19.05.2014)
8. M.L.Bishop, E.P.Fody, L.E.Schoeff. Clinical Chemistry - Principles, Techniqes, and
Correlations (7th edition). USA: LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS; 2013
9. Oslo Universitetssykehus http://tinyurl.com/q7ko4u3 (19.05.2014)
10. Puls-Norge.no http://tinyurl.com/omo69r2 (15.05.2014)
11. Vacutainer.com http://tinyurl.com/pcc76qq (15.05.2014)
12. Puls-Norge.no http://tinyurl.com/qxgbc98 (15.05.2014)
13. rndsystems.com http://tinyurl.com/ovytjgq (15.05.2014)
14. Urdal P, Brun A, m.fl. Medisinsk Biokjemi (4. Utgave). Haugesund: Akademisk
fagforlag AS; 2009.
15. Laboratoriehåndboka til Universitetssykehuset Nord-Norge.
http://tinyurl.com/nzy736a (12.05.2015)
16. Nevro.legehandboka.no http://tinyurl.com/pjj5vfx (12.05.2015)
17. Statistikk for laboratoriet. Thoresen T. Statistikk for laboratoriet (2.utgave).
TROMSØ: Lundblad Media AS; 2011.
18. Westgard.com http://tinyurl.com/2esfpp6 (21.05.2014)
19. NKK-ekv.com http://tinyurl.com/o7vhq72 (05.05.2014)
!
!
!
!
!
!
Vedlegg:!
I!vedleggene!er!middelverdien!i!RST!glass!markert!med!rødt!dersom!verdien!er!over!
optimal!øvre!grense,!og!blått!dersom!verdien!er!under!optimal!nedre!grense.!Alle!
verdiene!har!beneving:!pmol/L!
!
Vedlegg!1:!!Resultater!for!insulin!
Prøve
SST 1
SST 2
Insulin
Middelverdi
RST 1
RST 2
SST
Middelverd
Optimal
Optimal
Differanse av
i RST
nedre
øvre
middelverdiene
grense
grense
1
15,10
14,48
14,79
14,89
14,32
14,61
13,64
15,94
0,18
2
799,80
753,50
776,65
894,00
890,80
892,40
716,46
836,84
-115,75
3
46,12
44,63
45,38
48,12
45,62
46,87
41,86
48,89
-1,50
4
614,20
581,50
597,85
638,00
601,00
619,50
551,52
644,18
-21,65
5
75,66
72,70
74,18
78,46
72,73
75,60
68,43
79,93
-1,41
6
195,00
193,10
194,05
199,10
197,50
198,30
179,01
209,09
-4,25
7
64,27
62,34
63,31
69,32
65,98
67,65
58,40
68,21
-4,35
8
133,20
128,90
131,05
123,10
119,60
121,35
120,89
141,21
9,70
9
85,12
82,00
83,56
89,22
83,80
86,51
77,08
90,04
-2,95
10
350,30
340,00
345,15
253,60
247,30
250,45
318,40
371,90
94,70
11
81,61
77,85
79,73
83,89
81,66
82,78
73,55
85,91
-3,05
12
143,00
138,30
140,65
136,30
131,10
133,70
129,75
151,55
6,95
13
144,00
136,20
140,10
147,10
140,70
143,90
129,24
150,96
-3,80
14
48,62
45,92
47,27
49,80
47,50
48,65
43,61
50,93
-1,38
15
78,65
75,57
77,11
80,94
77,10
79,02
71,13
83,09
-1,91
16
33,65
31,01
32,33
33,60
31,47
32,54
29,82
34,84
-0,20
17
354,10
334,70
344,40
400,10
390,40
395,25
317,71
371,09
-50,85
18
53,22
49,61
51,42
57,28
54,69
55,99
47,43
55,40
-4,57
19
64,21
63,37
63,79
66,84
65,52
66,18
58,85
68,73
-2,39
20
895,00
845,40
870,20
901,50
842,40
871,95
802,76
937,64
-1,75
21
201,90
194,20
198,05
214,10
203,80
208,95
182,70
213,40
-10,90
22
97,60
95,37
96,49
91,84
87,04
89,44
89,01
103,96
7,05
23
225,40
218,10
221,75
238,40
227,90
233,15
204,56
238,94
-11,40
24
64,97
62,64
63,81
66,73
64,85
65,79
58,86
68,75
-1,98
25
64,63
63,17
63,90
63,15
59,24
61,20
58,95
68,85
2,71
!
!
!
Vedlegg!2:!Resultater!for!C6peptid!
Prøve
SST 1
SST 2
C-peptid
Middelverdi
RST 1
RST 2
SST
Middelverdi
Optimal
Optimal
Differanse av
RST
nedre
øvre
middelverdiene
grense
grense
1
371,1
364,8
367,95
367,1
365,4
366,25
354,81
381,09
1,7
2
3135
3153
3144
3194
3197
3195,5
3031,76
3256,24
-51,5
3
953,7
948,2
950,95
930,6
918,8
924,7
917,00
984,90
26,25
4
2972
2961
2966,5
2884
2844
2864
2860,60
3072,40
102,5
5
868,4
987,8
928,1
970,9
970
970,45
894,97
961,23
-42,35
6
1918
1907
1912,5
1915
1902
1908,5
1844,22
1980,78
4
7
887,8
883,8
885,8
890,4
868,8
879,6
854,18
917,42
6,2
8
1478
1490
1484
1439
1424
1431,5
1431,02
1536,98
52,5
9
402,5
425,1
413,8
416,3
414,6
415,45
399,03
428,57
-1,65
10
2385
2381
2383
2106
2077
2091,5
2297,93
2468,07
291,5
11
822,8
815,9
819,35
828
816,2
822,1
790,10
848,60
-2,75
12
842,7
842,4
842,55
825,2
813,8
819,5
812,47
872,63
23,05
13
1771
1754
1762,5
1747
1734
1740,5
1699,58
1825,42
22
14
804,2
799,1
801,65
797,8
789,4
793,6
773,03
830,27
8,05
15
1297
1304
1300,5
1318
1286
1302
1254,07
1346,93
-1,5
16
538,7
535,2
536,95
539,8
526,4
533,1
517,78
556,12
3,85
17
2028
2009
2018,5
2115
2095
2105
1946,44
2090,56
-86,5
18
780,1
779,5
779,8
801,7
780,5
791,1
751,96
807,64
-11,3
19
888,5
886,2
887,35
889,5
876,8
883,15
855,67
919,03
4,2
20
6294
6315
6304,5
6414
6213
6313,5
6079,43
6529,57
-9
21
1720
1713
1716,5
1720
1698
1709
1655,22
1777,78
7,5
22
1120
1116
1118
1071
1047
1059
1078,09
1157,91
59
23
2245
2240
2242,5
2254
2210
2232
2162,44
2322,56
10,5
24
1074
1070
1072
1086
1066
1076
1033,73
1110,27
-4
25
789,7
786,6
788,15
777,9
768,3
773,1
760,01
816,29
15,05
!
!
!
!
!
!
!
!
Vedlegg!3:!Resultater!for!FT3!III!
Prøve
SST 1
SST 2
FT3 III
Middelverdi
RST 1
RST 2
SST
Middelverdi
Optimal
Optimal
Differanse mellom
RST
nedre
øvre
middelverdiene
grense
grense
1
4,43
4,55
4,49
4,48
4,41
4,45
4,38
4,60
0,045
2
4,85
4,83
4,84
4,83
4,86
4,85
4,72
4,96
-0,005
3
3,51
3,46
3,49
3,55
3,56
3,56
3,40
3,57
-0,07
4
4,88
4,77
4,83
4,72
4,59
4,66
4,71
4,94
0,17
5
4,45
4,50
4,48
4,53
4,62
4,58
4,37
4,58
-0,1
6
4,47
4,80
4,64
4,67
4,65
4,66
4,52
4,75
-0,025
7
6,12
6,09
6,11
5,98
5,97
5,98
5,96
6,25
0,13
8
5,44
5,41
5,43
5,36
5,31
5,34
5,29
5,56
0,09
9
4,71
4,78
4,75
4,76
4,81
4,79
4,63
4,86
-0,04
10
4,83
4,81
4,82
4,65
4,75
4,70
4,70
4,94
0,12
11
4,48
4,47
4,48
4,46
4,44
4,45
4,37
4,58
0,025
12
5,42
5,41
5,42
5,4
5,42
5,41
5,28
5,55
0,005
13
6,32
6,57
6,45
6,37
6,43
6,40
6,29
6,60
0,045
14
5,72
5,79
5,76
5,59
5,73
5,66
5,62
5,89
0,095
15
4,99
4,97
4,98
5,05
5,14
5,10
4,86
5,10
-0,115
16
4,76
4,77
4,77
4,78
4,88
4,83
4,65
4,88
-0,065
17
5,34
5,35
5,35
5,07
5,12
5,10
5,22
5,47
0,25
18
5,45
5,38
5,42
5,42
5,34
5,38
5,28
5,55
0,035
19
4,61
4,73
4,67
4,6
4,59
4,59
4,56
4,78
0,075
20
3,84
3,79
3,82
3,56
3,71
3,64
3,72
3,91
0,18
21
4,6
4,70
4,65
4,55
4,55
4,55
4,54
4,76
0,1
22
5,02
5,02
5,02
4,98
4,91
4,95
4,90
5,14
0,075
23
3,99
4,04
4,02
3,88
4,03
3,96
3,92
4,11
0,06
24
5,08
5,08
5,08
4,97
5,01
4,99
4,96
5,20
0,09
25
6,06
6,08
6,07
5,88
5,94
5,91
5,92
6,22
0,16
!