Transcript Hélène Kiefer

Outils en épigénomique bovine
Hélène Kiefer et al., 3 avril 2014
Contexte
Outils
Exemples de résultats
Application à l’élevage
Franz Marc, The Yellow Cow
Contexte
Outils
Exemples de résultats
Application à l’élevage
Franz Marc, The Yellow Cow
Modifications épigénétiques
 Pas de variation dans la séquence d’ADN
 Altération de l’activité des gènes
 Transmission aux cellules filles à travers la division cellulaire
1 Méthylation
de l’ADN
2 Modifications
des histones
3 ARN non
codants
Séquence génomique, environnement, hasard :
les déterminants du méthylome
2 Etat de la cellule (tissu,
environnement, physiologie…)
3
Facteurs
stochastiques
10-3
CpG
1 Séquence
Strate supplémentaire qui vient s’ajouter à l’information
génétique
Méthylation de l’ADN et construction du phénotype
 Marques épigénétiques contrôlant le programme développemental et la
différenciation cellulaire : différentes entre types cellulaires, conservées entre individus
Un génotype unique, une multitude de types cellulaires
Méthylation de l’ADN et construction du phénotype
 Marques épigénétiques contrôlant le programme développemental et la
différenciation cellulaire : différentes entre types cellulaires, conservées entre individus
Un génotype unique, une multitude de types cellulaires
 Plasticité d’autres marques épigénétiques :
- Base de la variabilité phénotypique entre
animaux génétiquement identiques
- Réponse adaptative du génome aux
variations environnementales
Laurel et Hardy
Bressonvilliers (UCEA-INRA)
Cycles d’ "effacement-réétablissement" du
méthylome = reprogrammation épigénétique
-
+
D’après Nature, 6 mars 2014
+
Les phases de reprogrammation épigénétique sont des
fenêtres de sensibilité aux variations environnementales
Variations pendant la
conception et la gestation
-
+
D’après Nature, 6 mars 2014
+
3 générations potentiellement impactées par les
variations environnementales pendant la gestation
F1
Environnement maternel
 Alimentation
 Métabolisme
 Mammites…
F0
F2
Les phases de reprogrammation épigénétique sont des
fenêtres de sensibilité aux variations environnementales
Variations pendant la
gamétogenèse
-
+
D’après Nature, 6 mars 2014
+
Les spermatozoïdes archivent les variations
environnementales subies par le père
Conditionnement
(odeur + choc
électrique)
F0
Sensibilité
accrue à l’odeur
F1
Dias et
Ressler, 2013
Certaines marques épigénétiques sont résistantes
à la reprogrammation : effets transgénérationnels
Conditionnement
(odeur + choc
électrique)
F0
Sensibilité
accrue à l’odeur
F1
Dias et
Ressler, 2013
F2
Contexte
Outils
Exemples de résultats
Application à l’élevage
Franz Marc, The Yellow Cow
Pourquoi développer des outils en épigénomique
bovine ?
 Pour déterminer par quels mécanismes les variations environnementales ou
intrinsèques régulent l’activité du génome (et donc le phénotype)
 Pour affiner les modèles de prédiction du phénotype en fonction de
l’environnement
 Parce que plusieurs générations sont potentiellement concernées
(n générations ≤ 3 pendant la gestation)
 Pour déterminer les marques de méthylation résistantes à la reprogrammation
épigénétique et les éventuels effets transgénérationnels
(n générations > 3)
Pourquoi développer des outils en épigénomique
bovine ?
 Pour déterminer par quels mécanismes les variations environnementales ou
intrinsèques régulent l’activité du génome (et donc le phénotype)
 Pour affiner les modèles de prédiction du phénotype en fonction de
l’environnement
 Parce que plusieurs générations sont potentiellement concernées
(n générations ≤ 3 pendant la gestation)
 Pour déterminer les marques de méthylation résistantes à la reprogrammation
épigénétique et les éventuels effets transgénérationnels
(n générations > 3)
Nécessité de développer un « épigénotypage » de masse,
de manière à disposer d’un volume de données suffisant
pour évaluer une possibilité d’utilisation en sélection animale
Outil développé au laboratoire : MeDIP-chip
From : http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=33
Outil développé au laboratoire : MeDIP-chip
Conception d’une puce bovine ciblant les régions
régulatrices potentielles de 21 416 genes
-2000 pb
0
34 sondes/gène
From : http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=33
+1360 pb
Contexte
Outils
Exemples de résultats
Application à l’élevage
Franz Marc, The Yellow Cow
Trois types de comparaisons autour du foie
2 Deux races/environnements
3
1 Trois tissus
Effet du clonage sur
l’âge
Trois types de comparaisons autour du foie
1 Trois tissus
Foie (n=19)
Fibroblastes (n=3)
Spermatozoïdes (n=4)
Mise en évidence de signatures épigénétiques caractérisant
les tissus = régions différenciellement méthylées entre tissus
Spermatozoïdes vs fibroblastes (3948)
Spermatozoïdes vs foie (5634)
Foie vs fibroblastes(1660)
Les signatures épigénétiques foie vs spermatozoïdes
sont enrichies pour les gènes du complément
Plus méthylé dans
les spermatozoïdes
Plus méthylé
dans le foie
60
50
Toutes régions
-log10(pvalue)
40
30
20
Complément
10
0
-1
-0.5
0
0.5
Différence de méthylation (Foie-Spermato)
1
Les signatures épigénétiques foie vs spermatozoïdes
sont enrichies pour les gènes du complément
Plus méthylé dans
les spermatozoïdes
Plus méthylé
dans le foie
60
50
Toutes régions
-log10(pvalue)
40
30
20
Complément
10
0
-1
-0.5
0
0.5
Différence de méthylation (Foie-Spermato)
1
Les gènes du complément sont hypométhylés dans le foie,
lieu de la synthèse des protéines du complément
Trois types de comparaisons autour du foie
2 Deux races/environnements
Holstein élevées en
France (n=19 femelles)
Japanese black élevées
au Japon (n=11 femelles)
Foie
La part la plus importante de la variance du
méthylome peut être associée à la race
Analyse en Composantes Principales – dimensions 1 et 2
Identification de 3642
signatures épigénétiques entre
Holstein et Japanese Black
Les signatures épigénétiques de la race sont
enrichies pour des gènes de la gestation
Plus méthylé chez
les J. black
Plus méthylé chez
les Holstein
20
Toutes régions
-log10(pvalue)
15
10
5
Gestation
0
-1
-0.5
0
0.5
Différence de méthylation (Holstein-JBlack)
1
Les signatures épigénétiques de la race sont
enrichies pour des gènes de la gestation
Plus méthylé chez
les J. black
Plus méthylé chez
les Holstein
20
Toutes régions
-log10(pvalue)
15
10
5
Gestation
0
-1
-0.5
0
0.5
Différence de méthylation (Holstein-JBlack)
1
Polymorphisme génétique ? Adaptation à la différence de
métabolisme au moment de la mise en place de la gestation
(déficit énergétique chez la Holstein) ?
Trois types de comparaisons autour du foie
3 Effet du clonage sur
l’âge
Jeunes clones (n=7)
Jeunes témoins (n=4)
Clones adultes (n=7)
Témoins adultes (n=8)
Identification de signatures épigénétiques du
clonage et de l’âge
Signatures épigénétiques
de l’âge (257)
Signatures épigénétiques
du clonage (87)
Le clonage interfère avec les signatures
épigénétiques de l’âge
Signatures de l’âge
Groupe contenant
les témoins adultes
Groupe contenant
les jeunes témoins
Signatures du clonage
Les clones se comportent comme des adultes
indépendamment de leur âge
Signatures de l’âge
Signatures du clonage
Jeunes témoins
Autres
Le pyroséquençage, une technique quantitative
pour valider les résultats d’épigénomique
Amplification
par PCR
Conversion
bisulfite
Pyroséquençage
ADN natif
ADN traité
Produit de PCR
Pyrogramme
C
U
T
39%
mC
C
C
61%
 Permet de quantifier l’incorporation de
nucléotide à chaque position (Dupont et al.,
2004; Tost et al., 2007)
 Faible débit (approche gène-candidat)
 Pyroséquenceur disponible au laboratoire
chr2:107460687-107464047 (CYP27A1)
Signature épigénétique de l’âge
Sondes
Sondes méthylées

Animaux
 
CpG
Séquence régulatrice
Jeunes clones
Clones adultes
Jeunes AI
AI adultes

chr2:107460687-107464047 (CYP27A1)
Signature épigénétique de l’âge
90
80
60
Animals
% methylation
70
50
40
30
20
10
CpG0

100
pos1
pos2
pos3
pos4
pos5
pos6
pos7
pos8
pos9
CpG positions
Jeunes clones
Clones adultes
Jeunes AI
AI adultes
Contexte
Outils
Exemples de résultats
Application à l’élevage
Franz Marc, The Yellow Cow
Elevage = utilisation en routine
 Conception d’outils de nouvelle génération pour l’analyse de la
méthylation  traités par les plateformes de génotypage
 Analyse d’autres tissus (facilité d’accès : sang, sperme) et réponses à
des changements environnementaux :
GenEpi : intégration de facteurs génétiques et épigénétiques pour
évaluer l’impact environnemental sur le phénotype à partir de
monocytes (sang) (coll. G. Foucras, M. Boutinaud, C. Leroux, UE/IE de
Bressonvilliers, Le Rheu, Theix/Monts d’Auvergne, partenaires privés :
Pilardière et Codélia)
Labcom SeQuaMol : évaluation moléculaire de la qualité de la
semence bovine (UNCEIA)
GenEpi : marqueurs épigénétiques de l’état
physiologique de la vache à partir de cellules circulantes
Fenêtre de
déficit
énergétique
GenEpi : marqueurs épigénétiques de l’état
physiologique de la vache à partir de cellules circulantes
Fenêtre de
déficit
énergétique
Echec de l’IA
Susceptibilité
aux maladies
GenEpi : marqueurs épigénétiques de l’état
physiologique de la vache à partir de cellules circulantes
Pratiques
d’élevage,
Nutrition et
Compléments
alimentaires
Echec de l’IA
Susceptibilité
aux maladies
GenEpi : marqueurs épigénétiques de l’état
physiologique de la vache à partir de cellules circulantes
Pratiques
d’élevage,
Nutrition et
Compléments
alimentaires
Echec de l’IA
Susceptibilité
aux maladies
associer aux marqueurs génétiques des
marqueurs diagnostics de l’état physiologique
de la vache et à plus long terme, prédictifs du
succès de l’IA
 Recherche de nouveaux marqueurs moléculaires de la fertilité chez les bovins
 Analyse de la variabilité de ces marqueurs en fonction
• de la diversité génétique: deux races laitières et deux races allaitantes
• des conditions environnementales et biologiques
- âge,
- éjaculats successifs
- conduites d’élevage,
- alimentation,
- stress,
- saison, température
 Mise en relation avec les caractéristiques de fertilité
• spermogramme (morphologie, mobilité…)
• fécondance, taux de non retour
• développement embryonnaire in vitro (N. Beaujean, V. Duranthon)



 Analyses bioinformatiques et statistiques : Luc Jouneau
 Pyroséquençage : Evelyne Campion
 Hélène Jammes, Michel Guillomot, Audrey Prezelin, Jean-Paul Renard
 Puces : Sandrine Balzergue (INRA Evry) et Marie-Laure Martin-Magniette (INRA Evry),
 Collection de foies : Pascale Chavatte-Palmer, Yvan Heyman (BDR, INRA)
 Collection de semence de taureaux :
 Animaux japonais : Masahiro Kaneda et Takashi Nagai, Tokyo University of Agriculture
and Technology, Japan
 Production et soin des clones : Daniel Le Bourhis, Christophe Richard, Valérie Hallé,
Alexandre Neveux (UCEA, INRA)