Transcript AXE 1 - Poisson Bouge

GDR PHYCOTOX - AXE 1
Phycotoxines & leurs dérivés
Caractérisation et devenir dans la
chaîne alimentaire
Zouher Amzil
Laboratoire Phycotoxines (PHYC)
1ère Assemblée Générale, 4-6 février 2014
1
AXE 1 - Laboratoires impliqués
• Laboratoire Phycotoxines (PHYC) – Ifremer
•
LNR-Biotoxines
de l’Anses
(suite à une restructuration : projets en cours de montage)
•
Ifremer Sète & UMR 5119 ECOSYM
(présenté dans l’axe 2)
2
Phycotoxines & microalgues toxiques
Accumulation &
Biotransformations
Production
Axes 3 & 1
Phycotoxines
Coquillages et poissons
Axes 1
Cuisson / Produit
transformé
Microalgues toxiques
Axes 2 & 1
Intoxications
Impact sanitaire
Impact économique
Axes 4 & 1
Axes 5 & 1
3
Phycotoxines répertoriées en
Diarrhetic Shellfish Poisoning
France métropolitaine
C H
3
C O O H
OHH
Phycotoxines lipophiles
O
H
3
C
O
CO OH
OH
OH
O
H
H 3C
N
O
Cl
O
O
OH
Cl-H2N
+
+
NH2
NH
OH
O
OH
N
O
R
3
H O
3
H
H
O
O
O
H H
O
H
OH
O
O
O
O
O
O
OH
OH
Azadinium sp.
O
O
O
Ovatoxine/Palytoxine
O
Ostreopsis (benthique)
Dinophysis acuminata
H
H
O
O H
Yessotoxins
HO
H
O
O
NaO3SO
O
.
O
HO
HC
CH
Alexandrium sp
Pectenotoxins
O
Neurotoxic Shellfish Poisoning
Groupe Azaspiracide
O
O H
O H
O
Alexandrium tamarense
O
H
N H
OH
O
O
O
O
H
N
-
Toxines Azaspiracid
émergentes Non encore
réglementées
Azadinium spinosum
OH
HO
NH
CH3 CH3
O
O
HO
Cl
O
O
O
NaO3SO CH
N
2
Cl-
Saxitoxin
HO
+
Groupe OSaxitoxine
Dinophysis spp.
H
NH
2
+
N H
O
NH
O
O
Groupe
pectenotoxine
H N
H
N H
N
O
O
O
-
HO
O
ParalyticOShellfish
Poisoning
H2N
H
O
O
Pseudonitzschia spp.
Dinophysis spp.
.
H
Azaspiracid Shellfish Poisoning
O O
O
OH
O
N
O
O
OH
OH
2
Pseudonitzschia
. spp.
DomoicAcid
3
H
OH
CO OH
Groupe
acide okadaïque
H
COO H
O
OkadaicAcid
O
O
O
H
O
H
Groupe acide domoïque
CH 3
O
O
H
OH
O
O
C O OH
O
O
OH
OH
Amnesic
Shellfish Poisoning
H
OH
N
OH
H
O
O C OO H
H
O
H
O
H
CH
O
3
NaO3SO
CH
O
HO
3
O
O
Brevetoxin
O
O
O
O
O
OH
Karenia brevis
O
O
Groupe Yessotoxine
O
NaO3SO
O
O
Alexandrium
Vulcanodinium
Protoceratium
reticulatum
ostenfeldii
O
(Pinnatoxines, spirolides)
4
O
Protoceratium reticulatum
Imines cycliques
O
O
O
O
OH
5
AXE 1 – Méthodes de
caractérisation des phycotoxines
 Pour les Travaux de recherche
 Profiles toxinique des microalgues et des produits de la mer
 Etude des conditions de production des toxines par le phytoplancton
 Etude des Processus contamination/décontamination & métabolisation
 Identification de nouvelles toxines et/ou de métabolites
 Suivi des toxines dissoutes via les échantillonneurs passifs,

etç,,,
 Il n’existe pas une seule méthode pour toutes les situations
 Approches analytiques ciblée et non ciblée
Mises en places à PHYC
En perspective au LNR - Anses
6
Criblage ciblé en CL-SMHR Q-TOF
Construction en cours au lab. PHYC d’une base de données
et d’une bibliothèque de spectromètres de masses
Toxin family
ASP
DSP
Cyanobacteria
Cyclic imines
(FAT)
PSP
NSP
Toxin group
Domoic acid
Okadaic acid &
dinophysistoxins
Azaspiracids
Pectenotoxins
Yessotoxins
Oscillatoxins
Gymnodimines
Spirolides
Pinnatoxins and Pteriatoxins
Saxitoxins
Tetrodotoxins
Palytoxins
Brevetoxins
Pacific Ciguatoxins
Caribbean Ciguatoxins
Number
Abbreviation
DA
Compound
9
Molecular structure
9
OA+DTXs
65
10
AZAs
PTXs
YTXs
n/a
GYMs
SPXs
PnTXs+PterT
Xs
STXs
TTXs
PLTXs
PbTXs (BTX)
P-CTXs
C-CTXs
30
16
31
9
4
11
/
4
/
/
4
11
12
12
18
18
8
16
27
2
18
/
1
/
/
/
 Problème d’étalons : seulement 20 étalons environ pour
l’ensemble des toxines répertoriées au niveau EU
7
Ex. criblage ciblé en CL-SMHR Q-TOF
Via la base de données PHYC
AZA‐1
PnTX‐G
AZA‐2
13‐desMe‐C
20‐Me‐SPX‐G
PnTX‐F
PTX‐2
PTX‐5
AZA‐3
OA‐ester
8
Ex. de criblage non-ciblé en CL-SMHR
Azadinium obesum
Non Toxique
AZA1 (M+H)+ 842.5068
AZA2 (M+H)+ 856.5224
AZA? (M+H)+ 716.4748
Azadinium spinosum
AZA1‐methyl ester (M+H)+ 856.5201
 77 signatures caractéristiques d’A. obesum, 59 pour A. Spinosum.
 95 signatures communes,
9
Criblage non ciblé : mise en évidence de toxines
émergentes ou nouvelles via Fractionnement Bio-guidé
Echantillon biologique
d’intérêt
Extrait brut
Activité biologique / Screening1
Analyse chimique & Criblage
Fractionnement – Purification
Criblage chimique
Evaluation activité biologique
1
CL-SMBR
1Diverses
CL-SMHR
cellulaires
lignées
Analyse des résultats
Comparaison aux bases de données
&
Bibliothèque de Spectres
10
Ex. de Criblage non ciblé
Fractionnement d’extrait de culture de V. rugosum
Scheme of extraction and purification of PnTX-G
CRUDE (A)
(2050 mg)
DCM fraction (B)
(442 mg; 22% of A)
Hexane phase
Aqueous phase
Extrait brut
Pinnatoxine-G
Aq. MeOH fraction (C)
(168 mg; 8% of A)
PnTX G
Crude extr.
DCM-fract.
SiO2-F2
(73 mg; 43 % of C)
Aq. MeOH
SiO2-F3
(39 mg; 23 % of C)
Geiger et al., 2013
11
Mise en évidence d’un
composé cytotoxique dans
l’extrait de Vulcanodinium
- Identification rapide (15
min) par criblage via la base de
données Munro (30000
composés)
Name
Portimine
RT
5.68
m/z
402.2278
Score (DB)
99.4
Diff (DB, ppm)
-0.82
Geiger et al., 2013
12
Laboratoire Phycotoxines - IFREMER
O
4 chercheurs (2 HDR), 3 ingénieurs, 5 TA,
3 thésards, 1 post-doc
O
O
O
O
O O
O
HO
HO
O
•
•
Cultures en continu de microalgues & Production de toxines
Identification et Quantification des toxines marines &
leurs métabolites via la CL/SM (BR & HR) et des outils
chimio-informatiques.
Bio-accumulation et métabolisation de biotoxines marines
dans les produits de la mer.
OH
O
NH
•
O
O
O
O
O
Spécificité PHYC
O
O
O
OHH
OH
O
O
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
OH
OH
H
H
O
O
OH
NaO3SO
HO
O
O
NaO3SO
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
H 2N
O
H
H
NH
N
+
NH 2 Cl +
Cl - H 2N
NH
OH
N
OH
C H
3
C O O H
H
C O O H
H
N
C
3
H
C O OH
13
Equipements & infrastructure PHYC
•
4 systèmes CL-SM/SM
•
2 CL-SMHR : Q-TOF & IT-TOF
•
1 CL/SM semi-préparative – isolement de toxines
•
3 CL/ fluorescence / barrette de diode
•
2 automates d’extraction, Chromoto flash- purification
•
Lecteur de plaque - tests fonctionnels
•
6 salles de cultures de microalgues toxiques & non toxiques
•
Laboratoire expérimentale humide
•
Compteur de particules et un cytomètrie de flux
•
Photo-bioréacteurs : pilote (2,3 L) & 2X (3X100 L)
•
Quatre microscopes & système d’acquisition d’images
•
…………….
14
Ex. Faits marquants PHYC
Mise en place de méthodes de quantification
 Toxines amnésiantes (ASP) par CL/DAD : acide domoïque & dérivés
 Toxines lipophiles en CL-SM/SM : groupes acide okadaïque,
Pectenotoxine, Azaspiracide, Yessotoxine, Spirolide, Gymnodimine,
Pinnatoxine
 Toxines paralysantes (PSP) par CL/FLD après dérivation post-colonne
 Palytoxines & Ovatoxines (PITX) en CL-SM/SM
 Cyanotoxines en CL-SM/SM : cylindrospermospine, nodularine,
anatoxines, microcystines, BMAA & analogues
 Participation avec succès à 7 exercices de validation interlaboratoires, au niveau international, des méthodes de détection
des toxines réglementées,
ainsi qu’aux exercices annuels d’inter-calibration Quasimeme.
15
Evolution méthodo : vers le Micro débit en CL/SM
Analyse en µ-CL/SM d’un
mélange étalons de
Cyanotoxines
 0,5 - 1 µl injecté, au lieu de 5 µl en CL/SM classique
 Temps d’analyse divisé par 3 & Sensibilité multipliée par 5
16
Production & isolement de phycotoxines
AZA crude extract
Azaspiracides (AZA)
Step 1
Extraction
A partir de culture en continu de 60 jours (1200 L)
 production de 10 mg of pure AZA1
Prix du marché : 180,000 $ / mg
 Isolement de nouveaux analogues :
AZA (m/z 716) & AZA (m/z 816)
1M NaCl
Hexane
100% EtOAc
90% EtOAc/MeOH
50% EtOAc/MeOH
100% MeOH
Step 2
Partitioning 1
Step 3
Silica gel
Step 4
Flash-phenyl hexyl
Step 5
Prep HPLC-C18/C8
Ethyl acetate
70%
EtOAc/MeOH
AZA1: Fr 24-34
AZA2: Fr 35-45
Purified AZAs
Jauffrais et al. (2012) Mar. Drugs ; Jauffrais et al. (2012) Anal.
Bioanal. Chem ; Kilcoyne et al. in preparation.
17
Projets PHYC en cours / Caractérisation des
toxines - Risques émergents (Priorités EU)
 Ovatoxines & Palytoxine / Ostreopsis ovata (Thèse C. Brissard 2011-14)
 Ciguatoxines / Gamberdiscus – Est Atlantique
(en partenariat avec ILM & NOAA)
 Pinnatoxines / Vulcanodinium rugosum (Etude DGAL/DGS/ANSES 2012-14)
 Cyanotoxines marines / Cyanobactéries (Thèse D. Réveillon 2012-15)
 Développement d’outil de criblage & Chimiodiversité (Thèse Z. Zendeng 2012-15)
 ……
 Besoins en étalons de toxines, matériaux de référence
pour le développement de méthodes & les études
toxicologiques, surveillance et étude d’impact…
Amzil et al (2012) ; Séchet et al. (2012); Hess et al. (2013)
Zendong et al (soumis) ; Brissard et al (en prép) ; Réveillon et al (en prép.)
18
Equipe PHYC
Merci pour votre
attention
Des questions?
19
Méthodes officielles EU de détection
des phycotoxines & leurs évolutions
C H
3
Toxines amnésiantes (ASP)
C O O H
H
C O O H
H
C O O H
N
C
3
H
1) Analyse chimique en CL/UV validée AOAC.
2) Test ELISA validé AOAC, peut également être utilisé.
 En cas de contestation, la méthode de référence
est l’analyse chimique
 Pas de perspectives d’évolution à moyen terme
20
Méthodes officielles EU de détection
des phycotoxines & leurs évolutions
Toxines paralysantes (PSP)
1) Bio-essai sur souris (BES), validé AOAC,
2) Analyse chimique en CL/Fluorescence : 2 méthodes
validées AOAC via dérivation pré et post-colonne
 En cas de contestation, la méthode de référence
O
H N
2
est le bio-essai sur souris
O
H
Evolutions possibles
H
+
NH
+
Méthode bio / récepteur du canal sodique
NH
N
Cl
-H
N
2
N
- Inconvénient : très faible marquage radioactif de l’étalon (3H-STX).
NH
OH
OH
- Avantage : utilisée pour la détection des ciguatoxines (émergentes en EU)
Méthode de dépistage type ELISA : non encore validée.
 Vers un remplacement du BES pour l’analyse des PSP ?
21
2
Méthodes officielles EU de détection
des phycotoxines & leurs évolutions
Toxines lipophiles réglementées
1) Analyse chimique en CL-SM/SM,
méthode de référence depuis 2011.
validée
EU,
2) Bio-essai sur souris / toxicité globale : utilisé pour la
détection de nouvelles toxines / système de vigilance.
 Période de transition : utilisation BES autorisée
jusqu’au 31/12/2014
 Pas de perspectives d’évolution EU à moyen terme
O
O
O
OHH
OH
O
O
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
H
OH
O
O
O
OH
H
O
O
O
OH
NaO3SO
HO
O O
O
O
NaO3SO
O
O
O
O
O
OH
O
NH
O
O
O
O
HO
HO
O
O
O
O
OH
O
O
22
Toxines émergentes / Priorités EU
Besoin de données
 Evaluation du risque lié aux toxines émergentes :

Cigautoxines  Gambierdiscus sp.

Ovatoxines & Palytoxines  Ostreopsis sp.

Pinnatoxines  Vulcanodinium sp.
 Besoins en étalons de toxines, matériaux de référence
pour le développement de méthodes & les études
toxicologiques, surveillance et étude d’impact…
P-Ciguatoxin 4B
H
O
Gambierol
HO
OH
Me Me H
H
O
O
E
D
B
C
A
O
O
O
H
H
H
H
H Me
H
O H
F
G
Me O
H
Me
OH
H
OH
HO
Me
Me
10
OH
OH
Me
OSO3Na
OH
HO
H
H
O
O
H
H
O
H
HO
H
O
Me Me
O
Me H
Me H
O
H
OH
H
O
H
H
OH
H
O
H O
H
100
H
O Me
HO
Me
H
110
O H
H
O Me
H
O
Me
OH
H
O
H
H
O
H
H
O
O
H
50
H
H
OH
H
O Me
90
H
O Me
H O
80
Me
HO H O
HO
Maitotoxin
OH
O
OH
H
120
H
OH
H
O
H
O H
H
NaO SO
OH 3
OH
40
O
H
H
30
H
H
O H
O
O H
H
Me
Me O
OH
Me
Me H
O
20
O
Me O
O
O
1
H
O
HO H
H
130
Me
OH
H
H
HO
H H
O
H H
O
H
142
Me
O H
H
OH
O
OH
O
O
H
HO
OH
H
O
OH
H
H
60
70
H
OH
OH
H
OH
O
H
OH
OH
23
Projets en cours / Implication PHYC
Caractérisation des toxines – Risques émergents
OVATOXINES (thèse de C. Brissard 2011 – 14) (PHYC, LOV) : purification à partir de
culture d’Ostreopsis ovata et niveaux d’accumulation dans les produits de la mer.
CYNOTOXINES MARINES (thèse de D. Réveillon 2012-15) (PHYC, LER-LR) : cultures de
cyanobactéries marines productrices et niveaux d’accumulation dans les organismes marins.
VULCANO & Pinnatoxines (EC2CO & DGAL 2013-14) (PHYC, LER-LR, ECOSYM) : Etude de
l’espèce émergente Vulcanodinium rugosum, producteur de pinnatoxines, découverte en
Méditerranée en 2010 & acquisition de données pour l’évaluation du risque sanitaire.
LAGUNOTOX (Fondation TOTAL 2014-16) (PHYC, LER-LR, ECOSYM) : Espèces toxiques
émergentes dans les lagunes méditerranéennes : mise en évidence des zones à risque,
toxicité et traits écophysiologiques - Aide à la mise en place d’outils de surveillance.
Chimidioversité & analyse métabolomique des microalgues
ChiMiMar & AGILENT (Région PDL & Agilent, 2011 - 14) : développer des outils bioinformatiques pour la CL-SMHR & construction d’une base de données et d’une bibliothèque
de spectres de masse Phycotoxines
COSELMAR (Région PDL 2012 – 16), développement de :
•
Outils de criblage des toxines en CL-SMHR & d’échantillonneurs passifs (thèse Z. Zendong)
•
Méthodes de détection des toxines paralysantes dissoutes dans l’eau de mer
24
Projets en cours / Implication PHYC
Ecophysiologie des microalgues toxiques
COSELMAR (Régi on PDL 2012 –2016) (PHYC, LER-MPL) : Toxicité de Dinophysis acuminata &
mixotrophie - développement et mise en place de cultures associées de cryptophyte / cilié /
Dinophysis sp.
DOUALEX (Région Bretagne 2013-2015). Ifremer (Pélagos-coord, RDT, LER-BO & PHYC) &
SBR : étude des efflorescences d’Alexandrium minutum survenues pour la 1ère fois en 2012
en rade de Brest à Daoulas .
Inter-actions Toxines algales / Mollusques bivalves
ACCUTOX (ANR-CESA 2013 – 16), UMR-LEMAR-Coord., Ifremer (PHYC, LER-LR), EPOC, Anses
Evaluer l’impact des proliférations d’algues toxiques et des modifications de l’environnement sur
les réponses physiologiques et la bioaccumulation des toxines dans les huîtres.
APOTOX (EC2CO 2012-2014) (UMRs-RIME-coord., ECOSYM), Ifremer (PHYC, LER-LR) :
étude des effets apoptotiques induits par les neurotoxines du dinoflagellé Al. catenella chez
l’huître Crassostrea gigas : conséquences sur la susceptibilité des huîtres aux pathogènes.
25
Système de vigilance / Recherche de toxines
émergentes ou nouvelles
non-risk area
Risk area
Suivi systématique mensuel
test-souris & analyse CL-SM (BH & HR)
26
Seuils de sécurité sanitaires
internationaux
par kg de chair de coquillage
Groupes Acide Okadaïque & Pectenotoxine = 160 µg
Groupe Azaspiracide = 160 µg
Groupe Yessotoxine = 3200 µg
Groupe Acide Domoïque = 20 000 µg
Groupe Saxitoxine = 800 µg
Groupe Brevetoxine = 800 µg
Groupe Palytoxine (30 µg, selon EFSA)
27
Mise en évidence des toxines lipophiles
en France métropolitaine
En
plus
des
groupes
AO/DTXs, PTXs, mise en
évidence pour la 1ère fois
en France des :
- Spirolides en 2006’
- Azaspiracides en 2006’
- Yessotoxines en 2007’
-
Ovatoxines en 2008
- Pinnatoxines en 2010
PnTXs
OVAT
(Amzil et al, 2007 ; 2008 ; 2012, Séchet et al., 2012;
Hess et al., 2013)
28
Stratégie de mise en évidence de toxines
émergentes ou nouvelles
Fractionnement bio-guidé
Vulcanodinium
rugosum
Crude extract
Biological Screening
and
Metabolomics: Dereplication1,2
Fractioning
Fractions
Chemical analysis
- CL-SMBR
- CL-SMHR Q-ToF
Evaluation of biological activity
-Cytotoxicity KB cells
-Fly larvae
-bacteria
Data analysis
(comparison to large natural product libraries2)
(1) Kristian F. Nielsen et al. J Nat. Prod. (2011) 74, p2338-2348
(2) http://www.chem.canterbury.ac.nz/marinlit/marinlit.shtml
29
Classification des Phycotoxines
Selon la nature chimique
(toxine de base)
Selon les signes cliniques
d’intoxication
Groupe Saxitoxine STX
PSP : Paralytic Shellfish Poisoning
Groupe Acide domoïque AD
ASP : Amnesic Shellfish Poisoning
Groupe Acide okadaïque AO
Groupe Azaspiracide AZA
Groupe Pectenotoxine PTX
Groupe Yessotoxine YTX
Groupe Imines cycliques (PnTX,
SPX, Gym)
Groupe Brevetoxine BTX
Groupe Ciguatoxine CTX
Groupe Palytoxine PlTX
DSP : Diarrheic Shellfish Poisoning
Classées DSP
Toxicité non avérée chez l’Homme
NSP : Neurologic Shellfish Poisoning
Ciguatera
«Palytoxicose»
30
Objectifs du laboratoire PHYC
Caractériser les toxines et métabolites accumulés dans la chaîne alimentaire en
utilisant les procédés innovants de la spectrométrie de masse
Etudier l’influence des paramètres environnementaux sur la production de
toxines par des micro-algues & cyanobactéries pélagiques et benthiques
Optimiser les procédés de culture en masse de microalgues pour les études
expérimentales de contamination et pour la purification d’étalons de toxines
Explorer les voies métaboliques mises en jeu dans la bio-transformation de
toxines et dérivés accumulés dans la chair des mollusques bivalves
En étroite liaison avec des équipes spécialisées, comprendre les processus de
bio-accumulation, séquestration et élimination des toxines (Ex. Lemar-UBO)
Apporter une expertise scientifique et technique auprès du Rephy, des instances
ministérielles et institutionnelles, ainsi qu’auprès des acteurs socio-économiques.
31