Transcript RFU - 京都大学

RFUシグナル強度と
正規・対数正規・ポアソン対数正規・二項
分布
～ノイズとシグナル、ホモとヘテロ～
法数学勉強会
６月特別回：法医学会＠高知
2015/06/10
京都大学(医) 統計遺伝学分野
山田 亮
今日の主な内容
• 真のシグナルとノイズとの識別
• ヘテロ接合体の２アレルのシグナルのバラツキ
法数学勉強会
例会＠京都大学
2015/04/25
との重複があります…
“http://www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/wiki_tokyo/index.php講義・資料など：年度別”
から過去の勉強会の資料（2015/04/25分を含む)が見られます
勉強会会場
京大基礎医学
記念講堂
ノイズ
RFU (Relative Fluorescence Units)とノイズ
Journal of Forensic Sciences
Volume 58, Issue 1, pages 120-129, 6 NOV 2012 DOI: 10.1111/1556-4029.12008
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1556-4029.12008/full#jfo12008-fig-0001
多量・少量DNAの場合のノイズと、ネガコンのノイズ
Journal of Forensic Sciences
Volume 58, Issue 1, pages 120-129, 6 NOV 2012 DOI: 10.1111/1556-4029.12008
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1556-4029.12008/full#jfo12008-fig-0004
ノイズピーク高の分布
0は「ピークではない」からカウントされない
DNAなしでPCR実施
3130 Genetic Analyzer RFU ヒストグラム
DNAあり、PCRなし
http://www.bumc.bu.edu/gms/files/2013/03/Joli-Bregu-Thesis-2011.pdf
正規分布
• 左右対称
• 正・負
対数正規分布
左右非対称
正のみ
CCDカメラのノイズ
ポアソン分布
http://qsimaging.com/ccd_noise.html
https://www.kelk.co.jp/useful/netsuden9.html
CCDカメラのノイズ ショット・ノイズ
正規分布
対数正規分布
簡単なまとめ
ノイズの分布
非対称
離散
ポアソン分布
真のシグナル
ホモ接合体のピーク高はヘテロ接合体の
ピーク高の、だいたい、半分
ホモ接合体のピーク高はヘテロ接合体の
ピーク高の、だいたい、半分
• ヘテロ接合体のピークの方がノイズに埋もれやすい
• ヘテロ接合体なのに、片方のピークだけが見えることがある
• ピーク高の定量性の話
• エリア面積のことは、今回は忘れることにします
定量的PCR 発現量解析(mRNA)の場合
サイクル数
定量的PCR 発現量解析(mRNA)の場合
テンプレート量
Ｘ１０
サイクル数
定量的PCR 発現量解析(mRNA)の場合
テンプレートが
多いと
少サイクルで
立ち上がる
サイクル数
定量的PCR 発現量解析(mRNA)の場合
特定のRFU強度に着目して、立ち上がりに必要だったサ
イクル数を基に、サンプル内のmRNAコピー数を推定する
サイクル数
DNA鑑定の場合
特定のサイクル数における
RFU強度で比較する
サイクル数
シグモイドカーブ近似
サイクル数
b
シグモイドカーブ近似
• RFU = 0 + M/(1+exp(-k(C-b)))
M
RFU
• RFUは0を下限、Mを上限とするシグモイド
カーブ
• C(サイクル数)=bでRFUの中間値(M/2)となる
• Bの値は、サンプル濃度に依存する。その依
存の仕方は指数関数的
サイクル数
DNA鑑定
特定のサイクル数で切り取
る
高濃度サンプルは
高RFU
低濃度サンプルは
低RFU
サイクル数
1600
実際
1400
1200
600
100
Development and Validation of the
AmpF‘STR
Identifiler Direct PCR Amplification
Kit: A
Multiplex Assay for the Direct
Amplification of
Single-Source Samples
http://onlinelibrary.wiley.co
m/doi/10.1111/j.15564029.2011.01757.x/epdf
1600
1400
1200
600
100
シグモイドカーブ近似も悪くない
もっと近似に凝ってもよいけれど、考え方に
は違いは出ないので、これでよしとする
サンプル濃度と
RFUの関係
Log(濃度)に対して
RFUが
シグモイドになる
RFU
濃度
Log(濃度)
ヘテロ接合体
は濃度が半分
Ｘ２
RFUは？
濃度
Log(濃度)
ヘテロ接合体
は濃度が半分
Ｘ２
RFUは？
半分になることもあれば
半分より大きめになることもあり
半分よりずっと小さめなこともあ
る
濃度
Log(濃度)
ヘテロ接合体
は濃度が半分
92％
75％
RFUは？
48％
低シグナルでは
ヘテロは低め
31％
高シグナルでは
ヘテロは高め
25％
23％
Log(濃度)
ヘテロ接合体
は濃度が半分
92％
75％
RFUは？
48％
低シグナルでは
ヘテロは低め
31％
低い方のアレルは
ノイズに埋もれるかも
25％
23％
Log(濃度)
同じテンプレート量のつもりでも
カーブはばらつく
サイクル数
同じテンプレート量のつもりでも
カーブはばらつく
傾き
増幅効率が
ぶれる
テンプレート量が
ぶれる
立ち上がり
平行移動
サイクル数
バラツキ、エッセンス
• 何も制約がなければ、大きい方
にも小さい方にも均等にばらつく
• バラツキも増幅する
• 制約があると…
• 窮屈な側には窮屈にばらつく
• 上に窮屈 下に窮屈
• ゼロ(正)に窮屈
• 傾きは急峻側に窮屈
500
1000
指数分布
0
RFU
1500
傾き係数に
指数分布的バラツキがある場合
10
15
20
25
No. cycles
30
35
1500
1500
1000
500
RFU
1000
500
あるサイクルでの
RFU値の分布を取る
0
少し現実的なばら
つき加減にする
0
RFU
RFU
10
15
20
25
No. cycles
30
35
10
15
20
25
サイクル
No. cycles
30
35
傾き係数に
指数分布的バラツキがある場合
50
0
RFU分布は
下広がり
Frequency
頻度
100
150
200
Histogram of outs[40, ]
5
10
RFU
outs[40, ]
15
最後に二項分布
ヘテロ接合体の２アレ
ルのサンプル中のコ
ピー数も
ばらつく
1500
1000
500
0
• 1ml の血液から細胞・
ゲノムDNAの回収率が
10%として、試料を作り、
そこから1/100を実験用
に調整したとすると…
Frequency
• 25-100 ng のヒトゲノム
DNAに10,000強の遺伝
子コピーがある
Deviation from 0.5
0.48
0.48
0.49
0.5
0.50
0.51
Fraction of 1 allele
0.52
0.52
コピー数 100
10000
Deviation from 0.5
1500
2500
1000
Frequency
1500
0
0
0
500
500
500
1000
Frequency
1000
2000
1500
Deviation from 0.5
Frequency
1000
Deviation from 0.5
0.3
0.3
0.4
0.5 0.6
0.5
Fraction of 1 allele
0.6
0.44
0.44
0.46
0.48
0.5
0.50
0.52
Fraction of 1 allele
0.54
0.58 0.48
0.56
0.48
0.49
0.5
0.50
0.51
Fraction of 1 allele
0.52
0.52
コピー数 100
10000
Deviation from 0.5
2500
1500
1500
Deviation from 0.5
1000
Frequency
1500
0
0
500
500
500
1000
Frequency
1000
2000
２アレルのコピー数が 1 : 2 というのは
33% vs. 66% なので、相当コピー数が少なく
なる場合にのみ、稀に起きること
0
Frequency
1000
Deviation from 0.5
0.3
0.3
0.4
0.5 0.6
0.5
Fraction of 1 allele
0.6
0.44
0.44
0.46
0.48
0.5
0.50
0.52
Fraction of 1 allele
0.54
0.58 0.48
0.56
0.48
0.49
0.5
0.50
0.51
Fraction of 1 allele
0.52
0.52
まとめ
• RFUシグナル
Deviation from 0.5
Log(濃度)
Histogram of outs[40, ]
200
• ヘテロ２アレルのバラツキ：二項分布
Frequency
• 真のシグナル
1000
• ポアソン対数正規分布
500
• ノイズ
1500
• ノイズとシグナル
0.51
• 低シグナルでは、1/2コピーのRFU高は1/2より小さい
0.52
100
0.50
Fraction of 1 allele
Frequency
0.49
50
• コピー数~RFU関係：シグモイド曲線
0.48
0
• 低RFUに裾を引く
0
• 増幅のバラツキ：指数分布
150
• ～２倍
5
10
outs[40, ]
15
300
ノイズ・真のシグナルシミュレーション
200
150
100
50
• ノイズはポアソン
対数正規分布
0
• 増幅傾斜のバラ
ツキは指数分布
150
val
• ヘテロは二項分
布でばらつく
250
• ホモの真のシグ
ナルは150RFUは
ある
0
200
400
600
Index
800
1000
その他の参考資料・文献
• In general
• http://www.nfstc.org/?dl_id=26
• Peak Height Ratio (Heterozygous)
• http://www.nist.gov/forensics/upload/04_Final-2372A-Dilution-Series080314J.pdf
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24799164
• Low Template
• http://www.promega.jp/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issueswith-analysis-of-low-amounts-of-dna/
• http://www.cstl.nist.gov/strbase/LTDNA.htm
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