Transcript 葉緑体ゲノム装置の不連続進化仮説

葉緑体ゲノム装置の不連続進化仮説
1
葉緑体ゲノム装置の構造と進化
•葉緑体ゲノムとゲノム装置
•複製酵素，転写酵素，DNA結合タン
パク質，RNA結合タンパク質
•比較ゲノム学によるゲノム装置成分の
検索
•核様体の比較生化学
•ゲノム装置の不連続進化
2
シアノバクテリアと
植物・藻類の葉緑体および
それらの核様体
3
葉緑体ゲノム装置の起源の探索
複製：DNA polymerase(s)
転写：ファージ型RNA polymerase(s)
DNA結合タンパク質（転写因子）：
HU, DnaB helicase
SiR (亜硫酸還元酵素）
PEND （包膜のDNA結合タンパク質）
RNA結合タンパク質：Rbp / GRP
4
Discontinuous evolution of plastid
genomic machinery(1)
DNA polymerase
Adapted from N. Sato (2001) Trends in Plant Science 6: 151-156
5
Comparison of
various nucleoids
6
Lack of prokaryotic DNA-binding proteins in
plastids – comparative genomics
Pr o tein
E u-
C yano -
B u ch ne ra
b ac ter ia
b ac ter ia
sp.
R ho d o and
C hr o m o p hy te s
Gr ee n
alga e
La n d
p la nt s
cp
n uc
cp
n uc
cp
n uc
H U, IHF
1 -4
1
1
0 -1
0
0
1
0
0
H -N S,St pA
0 -2
0
1
0
0
0
0
0
0
F is
0 -1
0
1
0
0
0
0
0
0
D ps
0 -1
1 -2
0
0
0
0
0
0
0
D naB
1
1
1
1
0
0
0
0
0
D na A
1
1
1
0
0
0
0
0
0
O mpR -like
< 10
< 10
0
1 -2
0
0
0
0
0
Nt cA
0 -1
1
0
1
0
0
0
0
0
C bbR , R bc R
0 -2
1 -3
0
1
0
0
0
0
0
cp, chloroplast genome; nuc, nuclear genome. The Cyanidioschyzon data
were used as the ‘nuc’ data for Rhodo- and Chromophytes.
7
Presence of HU protein
in cyanobacteria and
rhodophyte plastids
8
Sulfite reductase is a major protein
in plastid nucleoid
9
Formation of particulate complex of purified
sulfite reductase with cpDNA
Water control
+ cpDNA (2 hr)
BSA control
+ cpDNA (24 hr)
10
Models of sulfite reductases
E. coli
Maize
11
転写活性に対するヘパリンとSiRの効果
Approximately, 10 sugar residues of
heparin counteract with the action of one
SiR molecule
12
SiR is also present in isolated moss nucleoids
13
Alignment of sulfite reductases of plants and
cyanobacteria
14
HUとSiRの
機能的比較
HU
SiR
15
DNA-binding proteins of plastids reported in the
literature
P ro te in
C lo n e d /
P la n t
Ta rg e t
F u n ctio n
H C (p la n ta cy a n in )
s p in a ch
unknow n
n u cle o id s tru ctu re U 7 6 2 9 6
H lp A
G u illa rd ia th eta (* 1 )
unknow n
n u cle o id s tru ctu re A F 0 4 1 4 6 8 1 0
S u lfite re d u cta se
p e a , to b a c co
unknow n
n u cle o id s tru ctu re D 8 3 5 8 3
6 8 -7 0
C N D 41
to b a cco
unknow n
re p re s so r/p ro te a se D 2 6 0 1 5
41
C h la m y d om on a s
re p lic a tio n o rig in
re p lic a tio n ?
A cce ss io n
S ize (k D a )
N on -sp ecific p rotein s
10
S e q u en ce -sp ecific
p rotein s
N d h I (F rx B )
h o m o lo g u e 1 8
R e g io n D -b in d in g p ro te in s p in a ch
re g io n D ( p sa A p ro m o te r) p sa A re g u la tio n
no
31
R e g io n U -b in d in g p ro te in s p in a ch
re g io n U ( p sa A p ro m o te r) p sa A re g u la tio n
no
34
PEND
TA A G A A G T
X 98740
1 3 0 (7 0 x 2 ?)
X 98744
1 7 0 /1 3 0 /6 3
pea
n u cle o id
a n ch o r in g
PD3
(E N B P 1 h o m o lo g u e )
pea
CD F2
s p in a ch
AAGAGGCTCGTGGG
rrn re g u la tio n
no
3 3 /3 5
CD F1
pea
in te rg e n ic rb c L -a tp B
tra n scrip tio n ?
no
11 5
AGF
b a rle y
A A G box
p sb D a ctiv a tio n
no
unknow n
PGTF
b a rle y
P G T (p la s tid G T ) b o x
p sb D a ctiv a tio n
no
unknow n
AT -r ich se q u e n ce
n u cle o id
s tru c tu re ?
16
紅藻と植物の DNA polymerases
17
植物オルガネラ型DNA polymerasesの系統
18
葉緑体とミトコンドリアの複製系の起源
植物・藻類では，葉緑体とミトコンドリアの複製系は
極めて似ており，同一のDNA polymeraseが働いて
いる。
しかしこのDNA polymeraseの起源は，シアノバクテ
リアやαプロテオバクテリアに求めることはできない。
動物や菌類と植物・藻類では，ミトコンドリアDNA
polymeraseが異なっている。
19
Origin of NEP
Recent evolution of T7-like
RNA polymerases
20
Origin of NEP
In angiosperm chloroplasts, two types of RNA
polymerases (RNAP) are present: one is a prokaryotic
RNAP called PEP, which is encoded in the chloroplast
genome, while another is a phage-type RNAP called
NEP, which is encoded in the nuclear genome.
The phage-type RNAP consists of a single polypeptide,
and functions in mitochondria of most eukaryotes
including yeast and human.
We analyzed the phage-type RNAP in the moss
Physcomitrella patens.
21
Model of organellar RNA polymerases in
in higher plants
22
Two cDNAs: RpoT1 and RpoT2
23
Expression and purification of
PpRPOT proteins
Nuclear- encoded
phage-type RNA
polymerase of
Physcomitrella patens
(moss)
24
Enzymatic
activity of the T760 ng/ml
type RNA
polymerases
in Physcomitrella
30 ng/ ml
mg
802ng/ml
40 ng/ ml
25
Mitochondrial targeting of the
PpRPOT proteins
26
Phylogeny of T7type RNA
polymerases
27
Phylogeny of T7-type RNA
polymerases(2)
28
Species
Bacteriophage T7
Protist
S. cerevisiae
D. discoideum
Algae
G. theta
P. provasolii
Moss
PpRPOT1
PpRPOT2
Fern
A. capillus-veneris
Gymnosperm
P. taeda
Angiosperms
Mitochondrion-type
A. thaliana
N. sylvestris
C. album
Z. mays
T. aestivum
Mt/Pt-type
N. sylvestris
A. thaliana
Plastid-type
A. thaliana
Z. mays
T. aestivum
Residues
Sequence
750-776 M F L G Q F R L Q P T I N T N K D S E I D A H K Q E S
1129-1155 Q V E T N L Q T V F I S D P F A V N P V N A R R Q K A
822-849 N I R T L E C D F I V V H N D D L L Q V D S N R Q R S
SVETAVQNISLLKCDENGPINKLKQRT
KINTVLQTISVDIHSEALPVVSAKQRS
960-986 L V K T S L Q V L A L R N L D A D Q P V L V Q R Q K S
938-964 L V K T S L Q V L A L R N T D D N H P V L A S R Q R S
QVRTSLQILALTDSNDTNMIMVRRQKS
LVRTSPQIWALRDETXKVWAIHKKLHS
851-875
876-901
863-877
850-874
880-904
Signature
sequence
LVKTTLQVLTLS--RETDKVMARRQMT
LIKTSLQILTLQ--RETDKVMVKRQET
LVKTSLQVLTLR--CDTDKVMAKRQRT
LIKTSLQVLTLQ--RETDKVMVKRQKT
LIKTSLQVLTLQ--RETDKVMVKRQRT
895-920 L I K T S L Q I L T L Q - - R E T E K V M V K R Q R T
886-910 L V K T S L Q T L S L Q - - H E T D Q V I V R R Q R T
868-892 L I R T S L Q V L A L Q - - R E G N T V D V R K Q R T
827-851 M I R T S L Q C L A L R - - R E G D A I A I Q R Q K A
824-848 M I R T S L Q C L A L R - - R E G D A I A T Q R Q K A
29
NEP-dependent
promoters of
chloroplast genes
might be specific to
angiosperms
NCII : Non-consensus
type promoter II, which
is transcribed by NEP.
30
Recent origin of NEP (2)
The NEP, a nuclear-encoded phage-type RNA
polymerase of chloroplasts, has been created by
duplication of the gene encoding a mitochondrial
counterpart.
Phylogenetic analysis of the polymerases as well as
the structure of NEP-dependent promoters suggest
that this gene duplication occurred after the
evolution of angiosperms.
Plant & Cell Physiology 43: 245-255 (2002)
31
Conflicting results on the targeting of
the two RNAPs of Physcomitrella
patens
1. Kabeya and Sato (2002) Plant Cell Physiol. 43: 245-255
Targeting to mitochondria (no targeting to chloroplasts)
2. Richter et al. (2002) Gene 290: 95-105
Dual targeting (mostly to chloroplasts)
32
Chloroplast targeting ??
Forced translation
from the first AUG
33
Mitochondrial targeting of the PpRPOT
proteins (2)
Translation within the
natural context
34
Two methionine codons
35
GFP in transient expression
36
Stable transformants
37
Immunoblot
38
Tagetitoxin sensitivity
39
Translation efficiency
40
コケでも被子植物でも
これまで他のグループによって２重ターゲティングが提唱されて
いた，細胞核にコードされたRNA polymerase (RPOT)は，いず
れもミトコンドリアだけにターゲティングされること，その理由は，
本来の5’ UTRコンテキストでは，２番目のメチオニンコドンだけ
からしか翻訳されないためであること，が判明しいた。
従って，本来の5’ UTRを持たない人工的に作られたGFP融合タ
ンパク質に基づくターゲティングは，正しい結果をもたらさないと
いうことが教訓である。
41
Dually targeted DNA-binding protein, PEND
42
若いエンドウの葉では，核様体が包膜に結合している
播種後６日目
播種後１４日目
5 µm
43
核様体の包膜結合に関与するDNA結合タンパク質
PEND protein: Sato et al. (1993) EMBO J. 12: 555-561.
44
Import of the PEND protein
45
Import of the PEND protein (2)
46
Import of the PEND protein (3)
Localization of the fulllength protein to the
chloroplast envelope
47
Dual targeting of the PEND protein
Initial translation product is targeted to plastid
envelope.
The N-terminus is processed. The C-terminus is
involved in membrane-binding.
If the N-terminal half of the mature PEND protein is
cleaved, this polypeptide may be re-targeted to the
nucleus.
BnGSBF1, a PEND homolog, is supposed to act as a
transcription regulator in CAB gene.
48
Selection of binding sites for the
PEND protein (cbZIP region)
49
Binding sites for the PEND protein in the
pea cpDNA
50
Gel-mobility shift assay of DNA-binding specificity of the
cbZIP domain
51
52
53
54
Discontinuous evolution of plastid
genomic machinery(1)
DNA polymerase
Adapted from N. Sato (2001) Trends in Plant Science 6: 151-156 55
Phase 1: 複製系の入れ換えと転写因子の喪失
56
Phases 2-3: 真核型転
写因子と転写系の移入
57
まとめ
プラスチドは，現存するシアノバクテリアの共通の祖先に近
い原核生物が，ミトコンドリアをもつ真核細胞内に共生する
ことによって生じたが，シアノバクテリアの系統におけるプ
ラスチドの位置や最も起源に近いプラスチドについては，ま
だ研究が必要である。
緑色系統と紅藻系統，紅藻とヌクレオモルフの単系統性を支
持するゲノムデータが示された。
ゲノム全体の比較により，シアノバクテリアからプラスチド
にいたる系統と進化を跡づけることができ，これによって，
新規光合成関連遺伝子の同定が進められている。
ゲノム装置（核様体）の構成成分では，シアノバクテリアが
持っているものの大部分がプラスチドでは失われていること，
紅色系統と緑色系統では成分が異なること，また，高等植物
では真核細胞由来の新たな成分が付け加わっていること，な
どが判明した。
58