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枯草菌C4-ジカルボン酸輸送体
DctPとMaeNの機能解析
理工学研究科分子生物学専攻
指導教官： 大西 純一
生内 寿文
枯草菌と大腸菌の
TCA回路代謝中間産物の輸送体
TCA回路
代謝中間産物
枯草菌輸送体
枯草菌
大腸菌輸送体
輸送体候補 （好気条件下）
Citrate
CitM, CitH, CimH
YraO
-
cis-Aconitate
-
-
-
Isocitrate
CitM?
-
-
a-Ketoglutarate
-
-
KgtP
Succinate
DctP
-
DctA
モノカルボン酸輸送体
Fumarate
DctP
-
DctA
Malate
MaeN, (YflS),
DctP
DctA
Oxaloacetate
-
-
-
MleN, CimH
Bastiaan P. Korm et al. Antonie Van Leeuwenhoek. 2003; 84(1): 69-80. より一部改
枯草菌のC4-ジカルボン酸取り込み
に関する2つの経路
第一経路
Succinate
第二経路
Fumarate
Malate
?
DctP
MaeN
?
DctB
DctS
?
YufL
DctR
DctS
P
YufM
P
P
DctR
YufL
YufM
dctP
maeN
P
DctPとMaeNについてのこれまでの実験
DctP
実験
方法
枯草菌欠損株
生育（相補）による
輸送基質の特定 DctA欠損大腸
菌の生育相補
輸送活性測定
細胞
再構成膜小胞
(Na+
H+
MaeN
or
/Dicarboxylate)
(Na+/Malate)
Succinate
Fumarate
Malate
－
Malate
－
Na+/Malate
symporter
最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化①
pDctPで形質転換
Growth (Klett)
Glucose
Succinate
Malate
Fumarate
1000
1000
1000
1000
100
100
100
100
10
10
10
10
1
1
1
1
0
10
Time (h)
20
0
10
Time (h)
20
0
10
20
Time (h)
〇野生株 ◇dctA欠損株 ◆dctA欠損株 pDctP
0
10
Time (h)
20
大腸菌を培養
（pDctP保持株はDctPを誘導発現）
↓
集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁
↓
大腸菌懸濁液に1 mM 14C-コハク酸
を加え，氷上でインキュベーションし
てその取り込み活性を測定
Succinate uptake (nmol/mg protein)
dctA欠損大腸菌株の14C-コハク酸取り込み活性
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
Time (min)
野生株
dctA欠損株pDctP
4
dctA欠損株
5
Inhibitor (1 mM)
Inhibitor (1 mM)
Tar
Pyr
Keto
0
Oro
20
Isocit
40
Cit
60
Glu
80
Asp
100
Mal
野生株
Fum
100
Succ
120
Succinate uptake rate (%)
120
None
Cit
Isocit
Oro
Keto
Pyr
Tar
None
Succ
Fum
Mal
Asp
Glu
Succinate uptake rate (% Control)
DctP発現DctA欠損大腸菌株の
拮抗阻害剤存在下での14C-コハク酸取り込み
DctA欠損株 pDctP
80
60
40
20
0
dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込み活性
大腸菌を培養
（プラスミド保持株はそれぞれの
タンパク質を誘導発現）
↓
集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁
↓
大腸菌懸濁液に1 mM 14C-リンゴ酸
を加え，氷上でインキュベーションし
てその取り込み活性を測定
Malate uptake (nmol/mg protein)
30
25
20
15
10
5
0
0
1
DctA欠損株
2
3
Time (min)
4
DctA欠損株 pDctP
5
Lineweaver-Burk plot
25
20
15
10
Eadie-Hofstee plot
0.5
V (nmol/mg protein/min) -1
1/V (nmol/mg protein/min) -1
Malate uptake (nmol/mg protein/min)
DctP発現dctA欠損大腸菌株の
14C-リンゴ酸輸送の速度論的解析
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-10 0
10
20
30
40
50
60
1/[S] mM -1
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
Malate (mM)
30
25
20
15
10
5
0
0
100
V/[S]
Km (µM)
2.0
Lineweaver-Burk plot
Eadie-Hofstee plot
363
75
411
(343)
68
200
DctA欠損株
te
ala
M
Fu
m
ar
at
e
at
Su
cc
in
os
uc
Gl
e
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
e
DO600
最小培地でのdctA欠損大腸菌株の生育の変化②
pMaeNで形質転換
DctA欠損株 pMaeN
大腸菌を培養
（プラスミド保持株はそれぞれの
タンパク質を誘導発現）
↓
集菌してリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁
↓
大腸菌懸濁液に1 mM 14C-リンゴ酸
を加え，氷上でインキュベーションし
てその取り込み活性を測定
Malate uptake (nmol/mg protein)
dctA欠損大腸菌株の14C-リンゴ酸取り込み活性
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
Time (min)
DctA欠損株
DctA欠損株 pMaeN
4
5
DctA欠損株 pDctP
大腸菌を培養
（プラスミド保持株はそれぞれの
タンパク質を誘導発現）
↓
集菌してリン酸緩衝液（pH 5-9）
に懸濁
↓
大腸菌懸濁液に20 µM 14C-リンゴ酸
を加え，氷上でインキュベーションし
てその取り込み活性を測定
Malate uptake (pmol/mg protein/min)
MaeN発現大腸菌株の
14C-リンゴ酸取り込みのpH依存性
300
250
200
150
100
50
0
4
5
DctA欠損株
6
7
pH
8
9
DctA欠損株 pMaeN
10
DctPとMaeNについて
本実験により明らかになった事実
DctP
実験
方法
枯草菌欠損株
生育（相補）による
輸送基質の特定 DctA欠損大腸
菌の生育相補
輸送活性測定
(Na+
H+
MaeN
or
/Dicarboxylate)
(Na+/Malate)
Succinate
Fumarate
Malate
Fumarate
Malate
Malate
細胞
Succ, Fum, Malと
再構成膜小胞 Aspも輸送基質
Na+/Malate
symporter
pH < 7で輸送活
性増大
dctPとmaeNのプロモーター活性測定
Malate
6
β-Galactosidase unit
栄養培地で枯草菌を前培養
↓
0-5 mM リンゴ酸を含む最小培地
で枯草菌を本培養
↓
OD600 = 0.5で集菌して
b-Galactosidase活性を測定
5
4
3
2
1
0
DctP
DctP
0
MaeN
168株
第一経路
第一・第二経路
1
2
3
Malate [mM]
PmaeN-bgaB
4
5
PdctP-bgaB
まとめ
• DctPの輸送基質はコハク酸，フマル酸，リンゴ酸
とアスパラギン酸などC4-ジカルボン酸を広く輸送
基質とする．
• DctPは枯草菌のC4-ジカルボン酸取り込みにお
ける第一経路の輸送体である事が示された．
• MaeNはNa+/Malate共輸送体と考えられているが，
大腸菌内では外液のpHが酸性条件で輸送活性
が検出された．
謝辞
松本 幸次 先生
朝井 計 先生
小笠原 直毅 先生
（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科）
細胞生化学研究室の皆様
本研究を進めるにあたってお世話になりました
上記の人々に深く感謝いたします