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挿入変異株作成 Isochorismate synthase欠損株作成にまつわるダイテツ日誌 微生研 小林 大哲 実験の流れ... ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ Isochorismate Synthase Fragment、条件検討 Isochorismate Synthase FragmentのPCR処理... ゲル抽出・精製、切り出し... Fragment、pKTN701酵素処理 pKTN701にLigation EtOH沈殿 SY327へTransformation... SmallScale・plasmid抽出、酵素処理電気泳動確認... ↓ ↓ ↓ 順調に進むはずが… 5/23 5/25 7/2 7/3 7/3,4 7/5 SY327/pKTN701 - SmallScale • Flagment Bandを確認できず...。 ↓ 頑張ってもう１度、やり直した • ２度も失敗...｡ • Transformationには問題なし...。 ↓ • Ligationが失敗しているのか再確認 Taq PCRによるFragment、再確認 EcoRI Sal I SY327 PCR EcoRI ・ ・ ・ Sal I SY327 ・ ・ ・ Fragment （Isochorismate） 挿入Flagmentを確認できず...。 ↓ 実験失敗... 原因は何...？ ・ Transformation後のプレート培養で増殖確認 ↓ ・ Trasformation、SmallScaleには問題なし… ・ VectorにFragmentが導入できていない… ↓ ・ Ligationが原因…！？ ・ Vectorが若干古かたので新規に調整しなおす 今後の方針 • Fragment、Vector共に新規調製して再度実験を行う • 問題点を洗い出せるように、正確な実験記録を取る...。 •