出力チーム - iGEM 2008

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Transcript 出力チーム - iGEM 2008

出力チーム
Vector側
BBa_F2620
pTet
PCRでつくります
LuxR
pLux
XbaI
SpeI PstI
LacZ
Luciferase
Venus YFP
レポーター遺伝子の現状
• LacZ
– BBa_J33202(miniprep済み)
• Luciferase
– Renilla Luciferase BBa_J52008 (miniprep済み)
– Firefly Luciferase BBa_I712019(transformation×)
• Venus YFP
– BBa_E2030 (transformation×)
– Craig からのVenus YFP(miniprep済み)
GFPとの比較(現在実験中)
• Inductionから出力までの時間の比較を比較
します。
問題点
• Luciferase
– Luciferinの膜透過性について
• pHを下げる(pH4.5程度)やEDTAで処理することで膜透
過性が上がるという報告があります。
• セレンテラジン(Renilla Luciferaseの基質)の場合多少
の膜透過性があり、発光実験がなされているようです。
• Venus YFP
– Venus YFPのなかにPstIサイトがあるため、ソーイ
ングPCRで制限酵素サイトを消します
Luxオペロン(LuxCDABE)
• Vibrio fischeri由来
– ルシフェリン合成(LuxCD-E)と、ルシフェラーゼ
(LuxAB)の発現をして発光するためのオペロン
• ルシフェリンが膜透過できなかった時のため
に準備
– 全長6kBp程度のためPCRができるか