Transcript PAM染色

PAM と PAS
（腎の染色）
PAM 目的
過ヨウ素酸メセナミン銀染色法（Periodic acid-methenamine-silver
stain）は、腎糸球体の特殊鍍銀法として、1953年にJones,D,Bによって
開発された染色法。
主として、糸球体の基底膜、メサンギウム細胞、細網血管を染めるだけでな
く、碑、リンパ節の細網構造、血管壁細胞間物質、間質結合組織の微細
な好銀性構築も染色される。
さらに、腎糸球体以外への応用として真菌、細菌、ウイルス粒子やメラニン、
ビリルビンに代表される生体内色素や甲状腺コロイド、クロム親和物質な
どが鍍銀される事が知られ、糸球体基底膜の特殊鍍銀法としての目的
だけでなく、多糖体タンパクの特殊染色法として広く用いられている。
Jones原法をHelly液固定組織片に応用した矢島法が広く一般に用いられて
いる。さらにPAM染色は超薄切片を用いた電子顕微鏡的観察も可能。
PAM 原理
H
H
O
O
H
OH
H
H
OH
O
O
H
OH
H
H
OH
O
過ヨウ素酸酸化
IO4
H
H
O
O
H
CHO
O
CHO
H
COOH
+
Ag
アルデヒド基を形成
CHO
Ag（NH3）２
O
O
COOH
+
Ag
O
H
O
O
H
CHO
H
O
H
COOH
+
Ag
O
COOH
+
Ag
銀鏡反応
PAM 試薬
• 1%過ヨウ素酸水溶液
• メセナミン銀液
3%メセナミン水溶液
50ml
5%硝酸銀水溶液
5ml
精製水
40ml
5%ホウ砂(ホウ酸ナトリウム) 5ml
• 4%中性ホルマリン
• 0.2%塩化金水溶液
• ジョーンズ補強液
• 酸性硬膜定着液
大谷法では
シュウ酸を使用
PAM 染色法
脱
パ
ラ
・
水
洗
１
％
過
ヨ
ウ
素
酸
精
製
水
水
洗
酸化
ジ
ョ
ー
ン
ズ
補
強
液
流
水
水
洗
定着
メ
セ
ナ
ミ
ン
銀
液
精
製
水
水
洗
鍍銀
酸
性
硬
膜
定
着
液
流
水
水
洗
４
％
中
性
ホ
ル
マ
リ
ン
精
製
水
水
洗
鍍銀補強
ヘ
マ
ト
キ
シ
リ
ン
流
水
水
洗
HE染色
塩
化
金
水
溶
液
流
水
水
洗
鍍金
エ
オ
ジ
ン
ア７
ル０
コ・
ー９
０
ル・
１
０
０
％
キ
シ
ロ
ー
ル
封
入
PAM 注意１
•
メセナミン銀液は58～60℃にああためておくと染色時間を短縮できる。
しかし染色の１時間も２時間も前に暖めておくと、銀鏡反応を開始して黒
くなってしまうので注意する。
•
メセナミン銀による鍍銀が本染色のもっとも重要なポイントであり、反応
時間は１時間を目安にし、切片が黄褐色になったところを見計らって鏡検
する。そのさい、太めの血管の基底膜が先に染まり、次に尿細管基底膜
が黒化し、さらに糸球体内の毛細血管基底膜が十分に黒化したのを確
認して鍍銀を終了するといい。
•
矢島法はメセナミン銀液の反応温度が高く、反応が終末点に近づくと急
激に黒化し、非特異的なメセナミン銀の沈着や共染がおこるので、慣れ
ないうちは黄褐色になった時点で室温、あるいは孵卵器で反応させると
鍍銀状態を判断しやすい。
•
銀液による反応は塩化金で黒化した基底膜の染色性がやや落ちるの
で過染気味に染めた法が良い。
PAM 注意２
•
メセナミン銀液による鍍銀のさい、金属ピンセット等を使用すると銀鏡反
応が起こるので注意する。
•
メセナミン銀液にごくわずかなゼラチンを溶かして鍍銀を行うと過剰な
銀鏡反応を防ぐ事ができ、スライドガラスに銀液が付着するのを防ぐ事
ができる。
•
4%中性ホルマリン水はJones原法では使用されず、実際省略しても染
色性に差はない。矢島は染色を翌日にまわす時に蒸留水に長く留めて
おくと鍍銀された基底膜などの反応産物が変色することがあるので、こ
の変色の防止という意味で用いている。
•
PAM染色後のHE染色は銀をのせた上に染色するので、通常の切片を
染色するより時間がかかる。また、後染色としてアザン染色やマッソン染
色を用いても良い。
PAM 染色結果
基底膜、細網線維
黒褐色
膠原線維
褐色
赤血球
赤色
PAS陽性物質
淡紅色
PAS 目的
PAS反応（過ヨウ素酸シッフ染色 / Periodic acid Schiff reaction）は
McManus(1946)、Hotchkiss(1948)らによって、多糖類の組織化学的証
明法として発展し、現在では肝臓のグリコゲン、消化管の粘液物質の証
明、色素顆粒や細胞顆粒、真菌、アメーバの識別および腎糸球体病変
の識別等、広く糖質の一般染色として知られている。
イメージ
H
O
O
H
CHO
CHO
+
+
シッフ試薬 シッフ試薬
O
原理はまだ完全に解明されていないが、
糖質を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアル
デヒド基がシッフ試薬と結合して、赤紫色の
化合物を形成する反応を利用したもの。
PAS 試薬
•
•
•
0.5%過ヨウ素酸水溶液
シッフ試薬
hot schiff
cold schiff
亜硫酸水
10%重亜硫酸ナトリウム 6ml
1N塩酸 5ml
精製水 100ml
PAS 染色法
過
ヨ
ウ
素
酸
水
溶
液
酸化
精
製
水
水
洗
シ
ッ
フ
試
薬
亜
硫
酸
水
×
脱
パ
ラ
・
水
洗
３
回
呈色
洗浄
流
水
水
洗
ヘ
マ
ト
キ
シ
リ
ン
核染
流
水
水
洗
脱
水
・
封
入
PAS 注意
•
•
•
•
•
脱パラ後の流水は、水洗により糖質が拡散、溶出するおそれがあるた
め、長く水洗しないこと。
過ヨウ素酸で酸化を行う場合には、適する温度、時間があり、一定範囲
外では反応は非特異的になるといわれている。過ヨウ素酸は毎回新調
し、常温で１５分をこえないようにすること。
シッフ試薬は染色する時に亜硫酸ガスのにおいがなければよく染まら
ない。また、試薬の汚染を防ぐために標本の水分をよく除去すること。
亜硫酸水は毎回新調し、シッフ試薬から直接水洗せずに亜硫酸水へ移
すこと。
核染色はPAS反応により核酸が酸化されて塩基性色素に親和性が増
しているので、染色時間は普通のときより短くていい。
PAS 染色結果
グリコゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白、粘液蛋白、糖脂質
陽性細胞
赤紫色
細胞内グリコゲンや粘液,卵巣の濾胞液,軟骨基質,甲状腺コロイ
ド,副腎のクロム親和性物質,下垂体の腺細胞の顆粒,リポフスチ
ン,腎糸球体や尿細管基底膜や硝子滴,小血管のフィブリノイド変
性や硝子化,前立腺内容,脾やリンパ節の細網線維や小血管,好
中球,肥満細胞,骨髄巨細胞,赤痢アメーバ,真菌類,細菌類