Transcript DNAシークエンス1
遺伝子の解析 第１弾 DNAについて＆PCR法 遺伝子とは？ ＤＮＡ（Ｄｏｅｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ） • ２本の鎖がお互いに絡まりあったような構造 • 規則正しく螺旋状になっている構造 • 前に進むにつれて右巻き（時計回り）に回る構造 二重螺旋構造 double helix １回転（ピッチ）で３４Å＝１０base ヌクレオシド〔nucleoside〕 とヌクレオチド〔nucleotido〕 二重螺旋構造の各々の鎖はヌクレオチドという 単位の繰り返し（重合）でできています。 アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）というプリン塩基、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）という ピリミジン塩基にデオキシリボースという五単糖が結合したものをヌクレオシ ドといい、さらにリン酸が結合したものをヌクレオチドという。 A ５´ ４´ ３´ ２´ 糖Sugar １´ ＋ Ｐ ＋ T G C ヌクレオシド ＝ Ｐ リン酸 Phosphate 塩基Base ヌクレオチドＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤＮＡの模式図 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ３´末端 Ｐ ５´末端 水素結合 A Ｇ A A Ｃ T Ｃ T Ｃ T T Ｇ A Ｇ ５´末端 ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ＤＮＡについてのまとめ どこにあるの か？ 何をしているのか？ 細胞核（ミトコンドリアにも全ＤＮＡ量の 約0.1～0.2％を含む） どのような構造か？ ２本のポリヌクレオチド鎖が、A-T、G-Cの 水素結合による塩基対を形成し、１０対を 一巻きとする、右巻きの２重らせん構造。 その他 遺伝情報の伝達 １、ＤＮＡのA/T比、G/C比はほぼ１。 ２、（A+T）/（G+C）の比は生物種により固有。 0.35～2.70の値をとる。ヒトでは1.52、酵母では1.79、大腸菌で は0.95。 ３、ＤＮＡの分子量は数百万以上。ヒトでは細胞１個 あたり約５～６pgのＤＮＡを含む。 ＤＮＡの変化 • ＤＮＡは加熱（通常７０℃以上）によりdouble helixがほど けてランダムコイルになる。これを変性（denaturation）ま たは融解（melting）という。 • 変性が進むにつれて紫外吸収（２６０ｎｍの吸光度）が増 大し、完全に変性すると４０～５０％の吸光度変化が見ら れる。これを濃色効果（hyperchromic effect）という。 • ５０％の変性が起こる温度を融点（Ｔｍ：midpoint temperature）という。水素結合が３対あるG-C結合は、２ 対のA-T結合より安定なのでG-C結合が多いほどＴｍは 高い。 • 変性したDNA溶液を冷却すると、相補的な鎖はひとりで に結合して元の2本鎖に戻る。これをアニーリング（焼きな まし）という。 ＰＣＲ（Polymerase chane reaction）法 ＰＣＲ法と は？ ステップ１（Denaturation：熱変性）、ステップ２（ annealing：焼きなま し）、ステップ３（Extension：伸長反応）の３ステップを１つのサイクルと して１つのテンプレート（鋳型）DNAから２つの複製を作り出し、この反 応を何サイクルも行うことでDNAを指数関数的に大量に増幅させる方 法 指数増幅期 サイクル数 プライマー ５´ スタート時 ０ １個＝２ 個 １サイクル終了時 ２サイクル終了時 １ ２ ２個＝２ 個 ４個＝２ 個 Ex) ２５ ２５サイクル行うと２ 個 ・・ ・ ・・ ・・ ・・ ・・・ PCR産物の増幅 nサイクル終了時 n ２ 個 ３３,５５４,４３２個 PCRの各ステップについて ステップ１（熱変性：denaturation） まず93～95℃に加熱することにより二本鎖になっている、テン プレート（鋳型）となるＤＮＡを引き離しプライマー（ＤＮＡを酵 素的に合成する際に使われる２０～３０塩基対の短いＤＮ Ａ断片。 増やしたい部分の両端に結合する塩基配列を持 つ。）がテンプレートに結合できるような状況をつくる。 テンプレートＤＮＡ ５´ ３´ ３´ ５´ テンプレートＤＮＡ ５´ ３´ ３´ ５´ 加熱（９３～９ ５℃） ５´ ３´ ３´ ５´ ５´ ３´ ３´ ５´ ステップ２（アニーリング： annealing） それぞれの一本鎖の相補的な部分にプライマーが二本鎖を形成 できる（annealing）温度まで冷却し、伸長反応が起こるようにする。 ３´ ５´ ５´ ３´ ３´ ３´ ５´ プライマー ５´ 冷却（５０～６０℃） ５´ ３´ ３´ ５´ ５´ ３´ プライマー ３´ ５´ 冷却（５０～６０℃） ３´ ５´ ３´ G G T G C C C A C C C G G G T C A T A ステップ３（伸長反応： Extension ） プライマーを起点として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素により５´ から３´方向にＤＮＡ合成が起こり、ＤＮＡの２本鎖が作られる。 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 完成 ＤＮＡ 鎖の伸長反応 （５´→３´へ向かう） プライマー Ｐ OH Ｐ Ｐ ５´末端 ３´末端 Ｇ A A Ｃ T DNAポリメラーゼにより次のTに相補的な P が選ばれ、３´末端の-OH基が ５´末端のリン酸基とホスホジエステル結 Ｇ 合する T T A ３´末端 新しくできた部分 Ｐ Ｐ テンプレートDNA Ｐ Ｐ Ｐ OH Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 A Ｇ A A T Ｃ T T Ｇ ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ PCR法の臨床応用 • • • • 結核菌、その他の細菌検査 HCV核酸定性、定量検査 ミトコンドリア病の診断 非侵襲的出生前診断（母体血中を循環し ている胎児細胞を用いる） • 染色体異数診断 などなど・・・・・・ 参考文献など 改訂 遺伝子工学実験ノート（羊土社） 改訂第２版 生化学ガイドブック（南江堂） 遺伝子の部屋 http://web.wtez.net/n/s/ns54007/gene/gene_main.html DNAシークエンス （ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む） 原理 オートシークエンサー（ABI PRISM３１０）のための反応では合成さ れるDNAを蛍光物質で標識します。このDNAを電気泳動し、泳動中 にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析し ます。 ABI PRISM３１０について ABI PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法 とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞ れに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける 方法（Dye Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメント を内径５０μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそ れぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができる。