Transcript マイクロアレイの臨床応用

マイクロアレイの臨床応用
東京大学大学院医学系研究科
健康科学・看護学専攻生物統計学
伊藤 陽一
がん臨床研究における
マイクロアレイの利用

臨床検体(がん細胞)特有の問題

遺伝子発現測定のバラツキ

遺伝子発現パターンによる
がんの診断と予後予測
(Ramaswamy, S. and Golub, T.R. 2002)
がん細胞検体の問題

どの細胞を用いるのか
(本質的に異質性が高い)
– 特定の状態のがん細胞を用いる
– がん細胞全体を用いる

対照細胞を何にするのか
(二蛍光標識法の場合)
– 対象者の正常細胞 (Laser Capture
Microdissection)
– 培養した細胞株(正常細胞 or がん細胞)
(Simone, N.L. et.al. 1998)
遺伝子発現測定のバラツキ

遺伝子発現測定のバラツキの原因
– 検体における細胞組成のバラツキ
– 検体の前処理段階におけるバラツキ
– 非特異的クロスハイブリダイゼーション
– アレイ間のバラツキ

実験計画の段階からバラツキを減らす工
夫が重要
(Lee, M.T. et.al. 2000)
(Kerr, M.K. and Churchill, G.A. 2001)
遺伝子発現パターンによる
がんの診断と予後予測

疾患分類研究
– 急性白血病分類
(Golub, T.R. et.al. 1999)
(Armstrong, S.A. et.al. 2002)

予後予測研究
– びまん性大細胞型Bリンパ腫 (DLBCL)
(Alizadeh, A.A. et.al. 2000)
(Rosenwald, A. et.al. 2002)
白血病とは

造血系細胞が骨髄の中で腫瘍化すなわち
白血病化した疾患

骨髄が白血病細胞により占拠され、正常
造血機能が抑制

赤血球減少による貧血、白血球特に好中
球減少による感染症、血小板減少による
出血傾向
白血病の病型分類






急性骨髄性白血病 (acute myeloid leukemia; AML)
FAB分類：M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7
急性リンパ性白血病 (acute lymphoblastic leukemia; ALL)
FAB分類：L1, L2, L3
慢性骨髄性白血病 (chronic myeloid leukemia; CML)
慢性リンパ性白血病群
– 慢性リンパ性白血病 (chronic lymphocytic leukemia; CLL)
– 前リンパ球性白血病 (prelymphocytic leukemia; PLL)
– 毛様細胞白血病 (hairly cell leukemia; HCL)
– 大顆粒リンパ球性白血病 (large granular lymphoblastic leukemia; LGLL)
慢性骨髄増殖性疾患群 (myeloproliferative disorders; MPD)
– 真性赤血球増加症 (polycythemia vera; PV)
– 本態性血小板血症 (essential thrombocythemia; ET)
– 慢性好中球性白血病 (chronic neutrophilic leukemia; CNL)
– 骨髄線維症 (myelofibrosis)
成人T細胞白血病・リンパ腫 (adult T-cell leukemia/lymphoma; ATLL)
急性白血病の鑑別診断

組織化学染色
– ペルオキシダーゼ染色
(陽性：骨髄性、陰性：リンパ性)
– エステラーゼ染色

細胞表面形質と細胞質内形質
– モノクロナール抗体

染色体と遺伝子異常
急性白血病の鑑別診断法
Catovskyらによるスコアリング・システム (Catovsky, D. et.al. 1991)
点数
2
B-細胞系
cyCD22
cyμ
CD10
CD19
CD24
T-細胞系
cyCD3
骨髄系
MPO(含cyMPO,および電顕
MPOの免疫染色も含める)
1
CD2
CD33
CD5
CD13(細胞表面/細胞質)
T細胞受容体
CD14(細胞表面/細胞質)
遺伝子再構成
Sudan black B
(βあるいはδ鎖) α-naphtyl esterase
0.5
TdT
TdT
CD11b
免疫グロブリンH鎖 CD7
CD11c
遺伝子再構成
CD15
点数の合計が2点以上なら各血球系の白血病と診断する。
cy: cytoplasmic (細胞質), MPO(myeloperoxidase): ミエロペルオキシダーゼ
Mixed Lineage Leukemiaの特徴 : t(4;11) etc.
B-細胞系：CD19発現,CD10非発現
骨髄系 ：CD15発現 (Pui, C-H. et.al. 1991)
疾患分類研究

AMLとALLの分類(Golub. et.al. 1999)
– 38検体(11 AML, 27 ALL)
– 検証用34検体(14 AML, 20 ALL)
– 6817遺伝子

MLLとAML,ALLの分類(Armstrong. et.al. 2002)
– 56検体(20 ALL, 17 MLL, 20 AML)
– 12600遺伝子
Neighborhood Analysis
“signal-to-noise”
ratio
1  2
1   2
(Golub. et.al. 1999)
Neighborhood Analysis
(Golub. et.al. 1999)
上位50遺伝子の遺伝子発現
(Golub. et.al. 1999)
疾患分類研究

AMLとALLの分類(Golub. et.al. 1999)
– 38検体(11 AML, 27 ALL)
– 検証用34検体(14 AML, 20 ALL)
– 6817遺伝子

MLLとAML,ALLの分類(Armstrong. et.al. 2002)
– 56検体(20 ALL, 17 MLL, 20 AML)
– 12600遺伝子
MLLとALL,AMLの分類
上位15遺伝子
(Armstrong. et.al. 2002)
主成分分析
8700遺伝子を用いた
3次元プロット
上位500遺伝子を用いた
3次元プロット
(Armstrong. et.al. 2002)
疾患分類研究の問題点

既存の検査で分類可能な疾患を遺伝発現
パターンで分類する必要性はあるのか

ｃDNAアレイを用いた場合の対照細胞は
適切かどうか

生物学的に解釈可能なのか

結果の再現性はあるのか
予後予測研究

DLBCLのサブグループ化(Alizadeh. et.al. 2000)
– 非ホジキンリンパ腫関連の12069遺伝子
– 二蛍光標識法(対照：種々のリンパ腫細胞株)
– 正常細胞を含む96検体、128アレイ

DLBCLの予後予測(Rosenwald. et.al. 2002)
– 240検体(モデル構築160,モデル検証80)
クラスター分析
Gene expression signatures
(Alizadeh. et.al. 2000)
サブグループ化
(Alizadeh. et.al. 2000)
サブグループの予後
IPI≦2 v.s. IPI>2
IPI≦2
IPI Score : (The International Non-Hodgkin’s
Lymphoma Prognostic Factors Project. 1993)
(Alizadeh. et.al. 2000)
予後予測研究

DLBCLのサブグループ化(Alizadeh. et.al. 2000)
– 非ホジキンリンパ腫関連の12069遺伝子
– 二蛍光標識法(対照：種々のリンパ腫細胞株)
– 正常細胞を含む96検体、128アレイ

DLBCLの予後予測(Rosenwald. et.al. 2002)
– 240検体(モデル構築160,モデル検証80)
背景因子
(Rosenwald, A. 2002)
クラスター分析結果
(Rosenwald, A. 2002)
サブグループごとの生存曲線
(Rosenwald, A. 2002)
予後予測スコアモデルの構築

Cox回帰による遺伝子スクリーニング
– 7399個中670個が1%有意
– 並べ替え検定により670個以上の遺伝子が
1%有意となる確率は0.005
– gene expression signatureに含まれる遺伝
子で対象者間のバラツキの大きいものを抽出
し、発現量の平均を取る(gene expression
signature value)
– 各gene expression signature valueによるモ
デル化
抽出された遺伝子と予後予測モデル
score = - 0.290 * germinal-center B-cell - 0.311 * MHC class II
- 0.249 * lymph-node + 0.241 * proliferation + 0.310 * BMP6
予後予測スコアによる層別
(Rosenwald, A. 2002)
IPIスコア分類による層別
IPIスコア0-1群における
予後予測スコアによる層別
(Rosenwald, A. 2002)
IPIスコア2-3群における
予後予測スコアによる層別
(Rosenwald, A. 2002)
IPIスコア4-5群における
予後予測スコアによる層別
(Rosenwald, A. 2002)
予後予測研究における問題点

gene expression signatureに含まれる遺
伝子選択の恣意性

モデル構築において、gene expression
signatureから遺伝子を選択する恣意性

予後予測研究におけるサンプルサイズ設計

構築したモデルは臨床上有用か
– サンプルの選択に依存するのではないか？
今後の課題

様々な がんにおける遺伝子発現と予後予測
– 特に生存など臨床上重要な結果との関連

マイクロアレイの特徴を考慮した解析法
– 測定の標準化
– 遺伝子スクリーニングを伴ったサンプルサイズ設計

抗癌剤の新規標的や著効または毒性発現が
予測されるサブグループの探索

臨床現場への応用
まとめ

遺伝子発現パターンを調べることは、疾
患の鑑別診断、予後予測に有用

臨床試験の枠組みの中で評価していく
ことが重要
参考文献

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Ramaswamy, S. and Golub, T.R. (2002). DNA microarray in clinical
oncology. Journal of Clinical Oncology 20, 1932-1941.
Simone, N.L. et.al. (1998). Laser-capture microdissection: opening the
microscopic frontier to meolecular analysis. Trends in Genetics 14,
272-276.
Lee, M.T. et.al. (2000). Importance of replication in microarray gene
expression studies: Statistical methods and evidence from repetitive
cDNA hybridizations. Proceedings of the National Academy of
Sciences 97, 9834-9839.
Kerr, M.K. and Churchill, G.A. (2001). Experimental design for gene
expression microarrays. Biostatistics 2, 183-201.
Golub, T.R. et.al. (1999). Molecular classification of cancer: Class
discovery and class prediction by gene expression monitoring.
Science 286, 531-537.
Armstrong, S.A. et.al. (2002). MLL translocations specify a distinct
gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nature
Genetics 30, 41-47.
Alizadeh, A.A. et.al. (2000). Distinct types of diffuse large B-cell
Lymphoma identified by gene expression. Nature 403, 503-511.
参考文献

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Rosenwald, A. et.al. (2002). The use of molecular profiling to predict
survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The
New England Journal of Medicine 346, 1937-1947.
Catovsky, D. et.al. (1991). A classification of acute leukaemia for the
1990s (Leading article). Annals of Hematology 62, 16-21.
Pui, C-H. et.al. (1991). Clinical characteristics and treatment outcome
of childhood acute lymphoblastic leukemia with the t(4;11)(q21;q23): A
collaborative study of 40 cases. Blood 77, 440-447.
The International Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors
Project. (1993). A predictive model for aggressive non-Hodgkin’s
lymphoma. The New England Journal of Medicine 329, 987-994.