Transcript D 液

海洋生命・分子工学基礎実験
タンパク質の取扱い
（4）
細胞分子工学研究室担当
4． SDS-ポリアクリルアミド
ゲルの調製
おまけ
(kDa)
120
90
48
36
28
20
• アフィニティークロマトグラフィーの結果の例
まずは・・・
• ゲル板を組み立てる。
– 当日実演します。
– メモの用意を！
使う溶液
1． A 液 （30% アクリルアミド水溶液）
2． B 液 （Lower Gel Buffer）
3． C 液 （Upper Gel Buffer）
4． D 液 （10% 過硫酸アンモニウム
ammonium peroxodisulfate = APS）
5． E 液 （10% テトラメチルエチレンジアミン
tetramethylethylenediamine
= TEMED）
分離ゲル
（separation gel = running gel）
• 以下の溶液を混ぜる（12.5% アクリルアミド）。
– A 液： 3.47 ml （3470 ml）
– B 液： 2.08 ml （2080 ml）
– 蒸留水： 2.78 ml （2780 ml）
• ここまで混ぜたところで脱気
– D 液： 28.5 ml
– E 液： 85 ml
• D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板
に流し込む。
分離ゲル
（separation gel = running gel）
• ガラス板に流し込んだら，上に静かに水飽和
1-ブタノールを載せる。
• 1-ブタノールはアクリルアミド水溶液とは混ざ
らない。ゲルの上の端が平らになるように 30
分ほど静置してゲルを固める。
• 固まったら，1-ブタノールを捨て，水道水→蒸
留水で洗う。
• 残った水をろ紙で拭き取る。
濃縮ゲル
（stacking gel）
• 以下の溶液を混ぜる。
– A 液： 375 ml
– C 液： 625 ml
– 蒸留水： 1.5 ml （1500 ml）
• ここまで混ぜたところで脱気
– D 液： 7.5 ml
– E 液： 50 ml
• D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板
に流し込む。
濃縮ゲル
（stacking gel）
• 気泡を閉じ込めないように，サンプルコウムを
差し込む。
• 30 分間ほど静置し，ゲルを固める。
• 固まったら，サンプルコウムとシールガスケッ
トを取り外し，水でぬらしたキムワイプと一緒
に，ラップで包んで冷蔵保存する（数週間は
保存可能）。
サンプルの調製
• SDS-サンプルバッファー
– 10% (w/v) グリセリン
– 5% (v/v) 2-メルカプトエタノール
– 2.3% (w/v) SDS
– 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)
• 当日は，上記のサンプルバッファーの 2 倍濃
縮ストック溶液を使用します（次のスライド）。
サンプルの調製
• 2x SDS-サンプルバッファーの実際の作り方
（以下のものを混ぜて 10 ml とする）
– 50% グリセリンを 4 ml
– 2-メルカプトエタノールを 1 ml
– SDS の粉を 0.46 g
– 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) を 2.5 ml
– 蒸留水を 2.5 ml
– 最後に少量のブロモフェノールブルーの粉を溶か
し，適度に青い色をつける。
サンプルの調製
• アフィニティークロマトグラフィーで分画した 3
つの試料 （A, B, C） を 50 ml ずつ，別の
チューブに取り分け，それぞれに 50 ml の 2x
SDS サンプルバッファーを加える。
• このとき，フタの周りにサンプルバッファーを
つけないように注意！
• 80℃ 程度で 5 分加熱して，タンパク質に
SDS を結合させる （泳動の直前に行なう）。
電気泳動の準備
• 下槽に泳動バッファーを
入れる （泡立てない）
• 泳動槽にゲルを取り付
ける
• 上槽に泳動バッファーを
注ぎ込む
• ケーブルを接続する
（赤は赤と，黒は黒と）
電気泳動用の電源
• 電圧 （voltage） の調節
• 電流 （current） の調節
• OUTPUT の ON/OFF
• READ と SET
• メインスイッチ
• ケーブルの接続
電気泳動用の電源の操作
• OUTPUT が OFF であ
ることを確かめる
• 念のため，VOLTAGE と
CURRENT のツマミを
最小にしておく
• READ/SET は READ
にしておく
• それからメインスイッチを
ON
電気泳動用の電源の操作
• READ/SET を SET に
する
• 今回の SDS-PAGE は
定電流で…
• CURRENT ツマミを回し
て 40 mA にする
（ゲル 1 枚あたり 20 mA）
• VOLTAGE ツマミを回し
て 300〜500 V 程度に
する
（数字が表示される）
電気泳動用の電源の操作
• READ/SET を READ に
する
（数字が 000 になる）
• OUTPUT を ON にする
• 電気が流れると，泳動槽
の電極から泡が出る
（確認しよう）
電気泳動用の電源の操作
• CURRENT が 40 にな
ったところで，「CC」 の赤
ランプが点灯
• 「CV」 のランプは消灯
– これが定電流 （Constant
Current） という意味
電気泳動用の電源の操作
• 泳動の後半，ゲル中の
電解質が減る
• 抵抗が増して電圧が上
がる
• 最初に SET した電圧を
上回ると，自動的に定電
圧運転に替わる
– 「CC」 ランプが消灯
– 「CV」 ランプが点灯
• その場合，VOLTAGE
の SET 値を大きくする