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大腸菌酸性膜リン脂質欠損株の
低浸透圧感受性に対する
機械刺激受容チャンネルの影響
細胞生化学研究室
奥田 芳子
pgsA 欠損株
wild
(Kikuchi et al. 2000)
Glycerol 3-phosphate
type
Δp
gsA
Phosphatidic acid
CDP-diacylglycerol
0%
PE
PG
PGP synthase (pgsA)
Phosphatidylserine
Phosphatidylglycerol phosphate
Phosphatidylethanolamine Phosphatidylglycerol (PG)
(PE)
Cardiolipin (CL)
50%
CL
100%
others
pgsA 欠損株は低浸透圧培地中で
生育が悪い。
Null pgsA mutant
400
400
350
350
300
250
300
klett unit
klett unit
wild type
200
150
250
200
150
100
50
100
0
0
50
0
100
200
300
minutes
400
0
100
200
300
minutes
LB medium (565 mosM)
LB medium minus NaCl (267.5 mosM)
400
低浸透圧ショック後にpgsA欠損株の細胞質体
積は縮小した。
(250 mosM → 125 mosM)
(有山修士論文 2003)
(%)
Wild type
Null pgsA mutant
1 min
5 min
大腸菌の低浸透圧応答
外膜
H2O
Mechanosensitive
channel(s) (MSC)
の速やかな開口
細胞質膜 (内膜)
イオン
細胞質
MscL (large conductance)
MscS (small conductance)
MscM (mini conductance)
MscK (interaction with K+)
目的
予想： pgsA欠損株ではMSCの開閉調節が異常である
• 大腸菌の3つのMSC遺伝子mscL, mscS,
mscKをあらゆる組み合わせで破壊した株
を作成する。
• MSC破壊による低浸透圧耐性への影響
を調べる。
実験に使用した大腸菌
すべての株でrcsA,lacY遺伝子を破壊した
pgsA+
pgsA-
Wild type
ΔmscL
S301R
S301RL
S330R
S330RL
ΔmscS
ΔmscK
ΔmscL, ΔmscS
S301RS
S301RK
S301RLS
S330RS
S330RK
S330RLS
ΔmscL, ΔmscK
S301RLK
S330RLK
ΔmscS, ΔmscK
ΔmscL, ΔmscS, ΔmscK
S301RSK
S301RLSK
S330RSK
S330RLSK
低浸透圧ショック後の生存率測定
LB培地でKlett40まで培養
↓
培養液を等量の830 mM NaClを含むLB培地と混合して
500 mM NaCl環境にする
↓
Klett120まで培養
↓
NaClを含まないLB培地で500倍に希釈して低浸透圧ショック
↓
適宜希釈
↓
LB寒天培地にスポット
↓
37℃で一晩培養
↓
コロニーを計測して生存率を求めた
強い低浸透圧ショック後の生存率
survival (%)
(1142.5 mosM → 270 mosM)
L: mscL
+
pgsA S: mscS
pgsAK: mscK
100
80
60
40
20
0
0％
0％ 0％
-LSK
-SK
-LK
-LS
-K
-S
-L
wild type
ショック前の生存率を100%とする
pgsA-株はMSCを破壊すると生存率が回復した
pgsA-株でMscLのみが存在するとき、低浸透圧
ショック後の生存に非常に有利
pgsA-株では一つのMSCから放出されるイオンが多い
pgsA-株の低浸透圧ショック後の細胞質体積の減少は
MSCの破壊により防げるか
シリコンオイル濾過遠心法
D.W.
(3 H2Oと14C-ラクトースの混合液)
大腸菌懸濁液
遠心
大腸菌がシリコン
オイル層を通過し、
過塩素酸層で固定
される
シリコンオイル
過塩素酸
細胞に取り込まれた
3Hと14Cの放射能
を測定
細胞質体積の算出方法
実験に使用したすべての株のlacY を破壊した。
外膜
細胞質膜
細胞質
H2O 透過スペース
ラクトース透過スペース
細胞質体積 =
(3H2O透過体積) – (14Cラクトース透過体積)
細胞質体積の算出方法
実験に使用したすべての株のlacY を破壊した。
外膜
条件
細胞質膜
１．ショック前後で細胞数が変化しない
細胞質
２．ラクトースが細胞質内に取りこまれない
H2O 透過スペース
ラクトース透過スペース
細胞質体積 =
(3H2O透過体積) – (14Cラクトース透過体積)
条件1 細胞数が低浸透圧ショック前後で変化しない
survival (%)
細胞質体積測定時の生存率
120
100
80
60
40
20
0
ショック前の生存率を100%とする
wild
type
-L
pgsA+
-S
-K
-LS
pgsA-
生存率が90%以下の変異株は細胞質体積測定実験には不適当
であると考え、用いなかった。
条件2 ラクトースが細胞質内に取りこまれない
放射線ラベル添加タイミングの検討
3H
volume (ul)
2.5
3
pgsA+
pgsA-
2.5
volume (ul)
3
14Cラクトース透過可能体積
2O透過可能体積
2
1.5
1
2
1.5
1
0.5
0.5
0
0
0 min
3 min
4 min
ショック後のラベル添加タイミング
0 min
1 min
2 min
3 min
4 min
ショック後のラベル添加タイミング
pgsA-株は低浸透圧ショックと同時に放射線ラベルを添加すると、ラ
クトースが細胞質内に取りこまれ、透過可能体積が大きく測定された
pgsA‐株ではMscS, MscKの欠損により
細胞質体積の減少がわずかに緩和された
relative volume of cytoplasm (%)
(250 mosM → 125 mosM)
ショック前の細胞質体積を100%とする
120
pgsA+
pgsA-
100
80
60
40
20
0
wild
type
-L
-K
wild
type
-L
-S
-K
まとめ
pgsA欠損株では
• 強い低浸透圧ショック後の生存率の大幅な減少は
MSCの欠損により回復した
• 弱い低浸透圧ショック後の細胞質体積の減少は
MSCの欠損によりわずかに緩和された
MSCからのイオンや溶質の過剰排出がpgsA
酸性リン脂質欠損株の低浸透圧耐性異常の
一因である