Transcript 福沢栄太 ポスター

LC/MSを用いたテフルベンズロン等7物質の分析
○福沢栄太 ，宮崎光代，河野洋一，野村孝一，小松一裕 財団法人 日本食品分析センター
・実試料分析例
【はじめに】
PRTR 第2種指定化学物質であるテフルベンズロン、フェナリモル、ヘキサコ
ナゾール、プロクロラズ、シクロナイト、ビフェントリン、チフェンスルフロンメチ
ルについて環境試料(大気)を用い、LC/MS及びLC/MS/MSポジティブ/ネガ
ティブ同時測定での検討を行った。
Cl
OH
F
Cl
Cl
C
C
NHCONHCO
F
OH
N
Cl CH2
N
Cl
Cl
F
(Z)-(1R)-cis-
(CH2)3CH3
O
CF3
C CH
C O
CH2
Cl
H
H
CH3 CH3
N
F
N
テフルベンズロン
N
フェナリモル
CH3
ヘキサコナゾール
H
NO2
OCH3
CO2CH3
S
O
N
N
SO2NHCONH
N
CH3
測定対象物質中、テフルベンズロンが最もイオン強度が取りにくく、ヘキサコ
ナゾール、プロクロラズ、ビフェントリンは比較的イオン強度が得やすかった
（図-3-1及び2）。IDLを表-3に、MDLを表-4に示す。SIMとSRMを比較すると同
程度のS/Nで検出できる濃度差はおよそ2～200倍程度であった。全般的に
SIMに比べてSRMは選択性が高く、ノイズレベルが低くなるためSRMでのS/N
が向上している。特にポジティブモードでは、カラムや溶媒等の影響からベー
スラインが高く、SIMとSRMのS/Nの違いが大きかった。一方、ネガティブモー
ドのシクロナイトにおいては、SIM測定においてもベースラインが低いために、
SIMとSRMのS/Nに大きな差は見られなかった。(図-4-1及び2)。
（装置検出下限はS/N = 10を目安に設定した。）
実試料(東京都多摩市)の測定では、テフルベンズロン、フェナリモル、ビ
フェントリンのクロマトグラム上に対象外物質のピークが認められたが、MDL
以下であった。
また、ポジティブモードでの実試料の測定においては全体的なベースライン
の上昇が認められた。さらにフェナリモル、ヘキサコナゾール、ビフェントリン
では対象外物質のピークが観察され、実試料の分析の際に低濃度レベルま
でこのような物質を測定するには、SIM測定よりも選択性の高いSRM測定の
方が望ましいと考えられた(図-5-1～4)。
一方、ネガティブモードの実試料におけるシクロナイトの測定では、SIM、
SRMともピークは認められず、SIM測定において溶離液中のメタノール濃度
の上昇とともに若干ベースラインの上昇が認められた程度であった。(図-6）
Cl
N
(Z)-(1S)-cis-
NO2
チフェンスルフロンメチル
Cl
CH2CH2O
N
N
C O
C CH
CH3
CH3CH3 O CH2
CF3
Cl
N
C
N
H
Cl
(CH2)2CH3
・装置検出下限(IDL)、分析法検出下限(MDL)
N
NO2
シクロナイト
ビフェントリン
プロクロラズ
表-3　装置検出下限(IDL)
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
IDL
（ng/mL）
注入液濃度
物質名
（ng/mL）
SIM
【方法】
・分析方法
アセトン10mLで洗浄、窒素気流下で乾燥させた固相カートリッジを捕集管と
し、一定流量（0.7L/min）で24時間大気試料を採取する。採取した捕集管を
バックフラッシュによりアセトン10mLで目的物質を溶出し、10mL容メスフラスコ
に受け、10mLに定容しろ過したものを試料液とし 、LC/MS-SIM法または、
LC/MS/MS-SRM法で定量した。
100
SRM
SIM
S/N
12.33
実試料
SIM 10.77
m/z=331(定量)
CV （%）
%
SRM
SIM
SRM
SIM
SRM
テフルベンズロン
5
0.5
0.55
0.062
12
12
2.9
3.2
フェナリモル
1
0.1
0.081 0.015
11
12
2.1
4.0
ヘキサコナゾール
1
0.01
0.16
0.0014
12
5.9
4.3
3.7
プロクロラズ
0.5
0.02
0.14
0.0029
13
10
7.3
3.6
シクロナイト
0.5
0.2
0.053 0.027
10
14
2.8
3.5
ビフェントリン
0.5
0.02
0.1
0.0016
11
14
5.3
2.0
チフェンスルフロンメチル 0.5
0.05
0.12
0.0062
4.2
6.3
6.1
3.1
＊装置検出下限（IDL）は、｢化学物質環境実態調査の手引き｣（平成17年3月）に従った。
%
12.00
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
捕集
Sep-pak PS-Air
溶出
10mL
アセトン
3
1m (0.7L/min×24hr)
濾過
0.2μm
LC/MS-SIM
LC/MS/MS-SRM
Positive及びNegative-ESI
100
実試料
SIM
m/z=333(確認)
図-1 分析フロー
HPLCはWaters社製 Alliance2795、質量分析装置はWaters社製 Quattro
Premier XEを用いた。
・測定条件
テフルベンズロン及びシクロナイトはESI ポジティブモード、他の5物質につ
いては、ESI ネガティブモードにより測定した(表-1)。また、カラムはOSD系を
用い、シクロナイトが、ぎ酸付加のプリカーサーイオンとして検出されたため、
ぎ酸系溶出条件で行った(表-2)。
表-1　イオン化法及びモニターイオン
物質名
0605021_024 Smooth(Mn,2x2)
テフルベンズロン
フェナリモル
ヘキサコナゾール
プロクロラズ
シクロナイト
ビフェントリン
チフェンスルフロンメチル
ESI（－）
ESI（＋）
ESI（＋）
ESI（＋）
ESI（－）
ESI（＋）
ESI（＋）
（eV）
25
40
35
20
10
15
25
25
25
30
25
8
15
15
teflubenzuron(378.9)
13.17
2463.17
SRM
11.00
0605021_024 Smooth(Mn,2x2)
確認 プリカーサー プロダクト
イオン
イオン
イオン
381
379
196
333
331
268
314
314
70
376
376
70
267
45
442
440
181
389
388
167
12.69
fenarimol
11.91
36.62
13.00
%
11.00
060507_010 Smooth(Mn,2x2)
12.00
13.00
teflubenzuron
13.15
478.62
100
%
Response
30000
120
140
160
180
12.00
0605021_024 Smooth(Mn,2x2)
100
%
SRM
0.02ng/mL
m/z=376→70
2.0
4.0
6.0
8.0
実試料
SIM
11.30
m/z=376(確認)
13.00
実試料
SIM
18.58
m/z=442(確認)
14.03
0
0
min
11.00
12.00
13.00
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
実試料
11.56
SRM 10.88 11.27
m/z=376→70
17.00
12.00
19.00
16.71 16.84 17.37
16.31
17.91
%
min
12.00
13.00
実試料
19.60 19.74
SRM
m/z=440→181
18.56
0
14.00
15.00
16.00
17.00
18.00
19.00
min
20.00
図-5-4 ビフェントリンのクロマトグラム
（環境大気）
F1:SIR of 3 channels,ES+
388
1.759e+004
10.87
100
10.34
8.06
8.57
8.76
9.44
9.26
9.74
実試料
SIM
m/z=388(定量)
8.96
min
9.00
12.09
18.00
F5:MRM of 1 channel,ES+
440 > 180.8
6.594e+002
15.30
14.53
13.26
0
11.00
16.00
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
bifenthrin
100
15.02
31.95
13.72
12.61
11.89
min
15.00
14.00
F3:MRM of 3 channels,ES+
376 > 69.7
13.94
5.938e+002
12.42
100
19.00
F5:SIR of 2 channels,ES+
442
1.370e+005
%
0
10.00
8.73
8.29 8.49
11.00
F1:SIR of 3 channels,ES+
389
10.83
1.964e+004
100
14.00
F3:MRM of 3 channels,ES+
376 > 69.7
2.518e+003
9.95
8.93 9.07
実試料
SIM
m/z=389(確認)
%
12.69
18.00
13.26
11.88
min
9.00
10.00
11.00
13.67
13.17
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
8.81
100
min
11.00
17.00
16.72
100
図-5-3 プロクロラズのクロマトグラム
（環境大気）
0
14.00
16.00
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
F3:SIR of 6 channels,ES+
376
13.88
3.041e+004
13.60
100
0
8.00
11.47
13.00
F1:MRM of 2 channels,ES+
388 > 166.8
5.616e+002
14.00
8.99
9.52
8.36
図-3-2 プロクロラズ
（標準溶液）のクロマトグラム
9.22
10.46
9.82 9.91
%
11.05 11.23
実試料
SRM
m/z=388→167
0
min
9.00
SIM 0.5 ng/mL
m/z=267
060507_010 Smooth(Mn,2x2)
F2:SIR of 2 channels,ES266.9
cyclonite(266.9)
1.750e+004
8.67
1925.48
F2:MRM of 1 channel,ES266.9 > 45.6
cyclonite
1.404e+003
8.67
128.03
100
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
100
%
%
1.23 1.73
0.01
8.20
9.47
10.00
4.0
6.0
8.0
5.72
8.23
9.39
11.00
F4:SIR of 2 channels,ES378.9
6.117e+003
11.81
12.41
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
10.95
0
min
2.0
3.60
6.73 7.11
実試料
10.60
SIM
m/z=379(定量)
11.05
100
9.98
0
min
2.0
10.0
4.0
6.0
8.0
10.0
0
min
11.00
12.00
13.00
14.00
%
図-4-1 シクロナイト SIM測定
（標準溶液）のクロマトグラム
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
図-4-2 シクロナイト SRM測定
（標準溶液）のクロマトグラム
%
濃度差 ×2.5
S/N SIM：10 SRM：14
・添加回収率試験
12.32
11.24
実試料
10.38
SIM
m/z=381(確認)
試料量
（㎥）
1
1
1
1
1
1
1
添加量
（ng）
500
100
100
50
50
50
50
測定回数 検出濃度
（回）
（ng/㎥）
5
588
5
107
5
106
5
47
5
50
5
49
5
48
回収率
（％）
118
107
106
94
99
98
96
変動係数
（％）
4.7
2.8
4.1
3.9
3.0
4.6
2.2
試料量
（㎥）
1
1
1
1
1
1
1
添加量
（ng）
50
10
1
2
20
2
5
測定回数 検出濃度
（回）
（ng/㎥）
5
51
5
7.0
5
0.8
5
1.3
5
17
5
1.5
5
4.8
回収率
（％）
101
70
84
66
86
75
96
変動係数
（％）
6.4
7.3
5.4
9.6
8.9
7.7
3.5
試料採取時、対象物質の固相カートリッジにおける安定性を比較するために、
遮光、非遮光での添加回収率の結果を表-6に示す。
固相カートリッジに標準物質を添加し、遮光下では固相カートリッジをアルミ箔
で覆い、非遮光下ではそのままで24時間大気試料を捕集した。
24時間採取での遮光、非遮光条件下の回収率にはほぼ差が認められな
かった。
Conc
10.0
9.64
8.73 9.13
7.08 7.83
5.37 6.35
4.0
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
0.20 1.86 2.44 2.82
100
4.16
12.00
13.00
teflubenz uron
13.16
42.41
100
%
10.42
8.04
min
2.0
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
実試料
SRM
11.17
10.02
m/z=379→196
実試料
SIM
m/z=267(定量)
1.76 2.01
min
11.00
F2:SIR of 2 channels,ES266.9
2.735e+003
0
0
固相カートリッジに標準物質を添加し、大気試料(東京都多摩市)1m3採取し
【分析方法】の操作に従い、添加回収実験を行った。また、無添加の場合につ
いても行った。結果を表-5-1及び2に示す。50～500ng添加での回収率は全て
良好であったが、フェナリモル、プロクロラズ、ビフェントリンでは低濃度での添
加回収率は6～7割程度であった。なお、無添加ではすべてMDL以下であった。
テフルベンズロン
フェナリモル
ヘキサコナゾール
プロクロラズ
シクロナイト
ビフェントリン
チフェンスルフロンメチル
F4:SIR of 2 channels,ES381
14.10
13.59
4.526e+003
100
・安定性の検討
（SRM測定）
0.5～
10ng/mL
0
0.0
Conc
200
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
min
15.00
14.00
図-5-5 チフェンスルフロンメチルの
クロマトグラム （環境大気）
4000
2000
5～
13.00
濃度差
SIM ×10 SRM ×25
6000
40000
12.00
実試料
SIM
m/z=440(定量)
0
min
11.00
13.77
prochloraz
12.40
301.71
100
F5:SIR of 2 channels,ES+
440
2.571e+004
18.29
min
14.00
F3:SIR of 6 channels,ES+
376
1.814e+004
13.00
14.00
%
%
12.00
13.00
bifenthrin(440)
14.99
865.16
8.05
60000
100
13.00
12.00
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
14.21
100
実試料
SIM
m/z=378(定量)
0
%
14.16
図-5-2 ヘキサコナゾールのクロマトグラム
（環境大気）
9.53 9.65
min
11.00
Compound name: teflubenzuron
Correlation coefficient: r = 0.999971, r^2 = 0.999941
Calibration curve: 861.089 * x + 63.6048
Response type: External Std, Area
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None
50000
%
13.71
13.21
表-5-2　添加回収実験結果(SRM測定)
R2 = 0.9999
80
12.84
11.88
060507_010 Smooth(Mn,2x2)
10.14
0
SIM測定用で0.5～200ng/mL、SRM測定用で0.01～10ng/mLの標準液を作
成した。各物質とも20倍の濃度範囲においてR2=0.9994以上の良好な直線性
が得られた。
60
14.00
F4:MRM of 1 channel,ES378.9 > 196
3.766e+003
%
テフルベンズロン
フェナリモル
ヘキサコナゾール
プロクロラズ
シクロナイト
ビフェントリン
チフェンスルフロンメチル
R2 = 0.9999
11.00
F3:SIR of 6 channels,ES+
378
13.40 13.77
1.369e+004
12.25
13.07
12.45
11.51
min
14.00
12.90
F3:MRM of 3 channels,ES+
314 > 69.7
13.39
1.903e+003
0
min
13.00
min
11.00
SRM
0.5ng/mL
m/z=379→196
物質名
y = 861.089 x+63.6048
%
10.78
12.00
14.00
実試料
SRM
m/z=314→70
11.67
F3:SIR of 6 channels,ES+
378
1.940e+004
SIM
0.5ng/mL11.07
10.28
m/z=376(確認)
min
物質名
40
14.00
F4:SIR of 2 channels,ES381
1.216e+004
図-3-1 テフルベンズロン
（標準溶液）のクロマトグラム
y = 388.927 x+514.586
13.60
12.16
13.00
100
13.87
100
表-5-1　添加回収実験結果(SIM測定)
Compound name: teflubenzuron(378.9)
Correlation coefficient: r = 0.999989, r^2 = 0.999978
Calibration curve: 388.927 * x + 514.586
Response type: External Std, Area
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None
min
12.00
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
F3:MRM of 3 channels,ES+
331 > 268
13.22
1.561e+003
100
SRM
12.78
12.25
11.00
14.00
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
・検量線
0
SIM
0
【結果および考察】
Response
12.00
0
ニードル洗浄条件
Wash Solvent：1%Formic Acid/Methanol
Purge Solvent：Ultra Pure Water
Wash Frequency：Inject
Flush Time(s)：6
Wash Time(s)：15
Wash Cycles：5
Secondary Wash Volume(μL)：600
Wash Sequence：Wash-Purge
10000
SIM
0.5ng/mL
10.77
m/z=378(定量)
11.00
12.00
0605021_024 Smooth(Mn,2x2)
prochloraz(376)
100
12.42
1845.60
SIM
5ng/mL
11.13
m/z=381(確認)
%
測定後にキャリーオーバーが認められた。また、試料測定後、対象物質以外の夾雑物質が
キャリーオーバーすることが認められた。付着箇所はシリンジニードル部であったため、以下
のニードル洗浄を注入毎に行った。なお、条件は(Waters社製 Alliance 2795)特有のものであ
る。
20
%
teflubenzuron(381)
13.14
1655.69
100
＊テフルベンズロン、プロクロラズ、ヘキサコナゾール及びビフェントリンは高濃度標準溶液
（SIM測定）
200ng/mL
SRM
F3:SIR of 6 channels,ES+
314
13.32
1.392e+005
実試料
SIM
m/z=314(確認)
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
Waters　Quattro Premier XE
キャピラリー電圧 1 kV［ESI（）］　2.5 kV［ESI（－）］
デソルベーション温度
400℃
イオン源温度
110℃
コーンガス流量 50L/hr デソルベーション流量 1000L/hr コリジョンガス流量 0.2mL/hr
20000
SIM
0
Waters Alliance2795
カラム
Sun Fire C18（2.1 mm×150mm×3.5μm)
溶離液
A；0.02 %ぎ酸水溶液：20 mMぎ酸アンモニウム水溶液＝1：1
B；0.02%ぎ酸メタノール溶液：20 mMぎ酸アンモニウムメタノール溶液＝1：1
0min
A : B = 90 : 10
0→8min
A : 90→5　B : 10→95　liner gradient
8→17min
A : B=5 : 95
17→25min A : B=90 : 10
流速 0.2mL/min ｶﾗﾑ温度 40℃ 注入量 10uL
0
SIM
5ng/mL
m/z=379(定量)
min
表-2　LC/MS及びMS/MS測定条件
70000
SRM
0605021_024 Smooth(Mn,2x2)
prochloraz(378)
100
12.42
2196.61
F4:SIR of 2 channels,ES378.9
1.863e+004
0
定量
イオン
379
331
316
378
267
440
388
13.00
060507_019 Smooth(Mn,2x2)
%
10.04
SIM
SIM
14.00
0
min
12.00
10.01
%
コリジョン
エネル
ギー
SRM
CV （%）
13.00
13.94
060507_037 Smooth(Mn,2x2)
テフルベンズロン
10
1
25
3.3
80
34
5.0
7.6
フェナリモル
2
0.2
4.6
0.3
18
21
7.1
3.9
ヘキサコナゾール
2
0.02
4.4
0.044
32
17
6.4
5.5
プロクロラズ
1
0.04
1.3
0.062
20
11
3.5
4.1
シクロナイト
1
0.4
0.85
0.68
35
31
2.4
4.4
ビフェントリン
1
0.04
2.0
0.042
58
52
5.4
2.7
チフェンスルフロンメチル 1
0.1
2.5
0.063
33
59
7.6
1.6
＊分析法検出下限（MDL）は、｢化学物質環境実態調査の手引き｣（平成17年3月）に従った。
100
コーン
イオン化
電圧
方法
（V）
MDL SRM 0.2 ng/mL
S/N
(ng/ m3m/z=267→45
)
（ng/mL）
SIM
100
図-5-1 フェナリモルのクロマトグラム
（環境大気）
注入液濃度
12.00
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
F3:SIR of 6 channels,ES+
333
3.735e+004
13.23
13.86
0
物質名
min
%
11.00
実試料
SRM
m/z=331→268
10.01
13.49
11.00
14.00
0
表-4　分析法検出下限(MDL)
・装置
12.78
12.33
11.00
大気試料
13.00
13.97
12.56
0
min
%
実試料
SIM
m/z=316(定量)
13.88
11.00
F3:SIR of 6 channels,ES+
316
1.244e+005
100
12.70
0
%
060507_038 Smooth(Mn,2x2)
F3:SIR of 6 channels,ES+
331
13.23
8.020e+004
14.00
F4:MRM of 1 channel,ES378.9 > 196
5.908e+002
%
実試料
SRM
m/z=267→45
6.0
8.0
5.91 6.40
5.60
7.45
10.0
F2:MRM of 1 channel,ES266.9 > 45.6
2.516e+002
7.64 8.01 9.01 10.23
0
11.48
12.28
min
2.0
12.51
13.71
4.0
6.0
8.0
10.0
14.11
0
min
11.00
12.00
13.00
14.00
図-6-1 テフルベンズロンのクロマトグラム
（環境大気）
図-6-2 シクロナイトのクロマトグラム
（環境大気）
【まとめ】
今回、テフルベンズロン等7物質の分析について、LC/MS及びLC/MS/MS
を用いた分析を行った。
本法により、大気試料中テフルベンズロンをSRM測定で10ng/m3、SIM測定
で数十ng/ m3、フェナリモルをSRM測定で1ng/ m3、SIM測定で十数ng/ m3、
ヘキサコナゾールをSRM測定で0.2ng/m3、SIM測定で4ng/m3、プロクロラズを
SRM測定で0.2ng/m3、SIM測定で3ng/m3、シクロナイトをSRM測定で2ng/m3、
SIM測定で3ng/m3、ビフェントリンをSRM測定で0.2ng/m3、SIM測定で6ng/m3、
チフェンスルフロンメチルをSRM測定で0.2ng/m3、SIM測定で7ng/m3で定量
が可能である。
また、環境試料(大気)を用いた分析法で、SIM測定と比較してSRM測定時
の選択性の高さによるS/Nの向上が改めて確認できた。なお、測定モード
（ポジティブ，ネガティブ）の違いとして、ポジティブモードでベースラインが高
い傾向があり、ネガティブモードでは低い傾向も改めてうかがえた。ポジティ
ブモードでは、大気中の対象外物質も検出する割合が高かった。
ネガティブモードで測定したシクロナイトにおいては、SIM測定でもSRM測定
でもほぼ同等のS/Nが得られ、シングルマス（LC/MS）でも同等の測定が出
来る場合も確認できた。
今回得られた知見は少ないが、今後対象とする環境試料媒体及び測定対
象物質を広げ、環境試料における測定モードの違いによる影響を検討したい。
図-2-1 検量線の一例（テフルベンズロン）
150000
表-6　遮光及び非遮光条件下での回収率
Compound name: hexaconazole
Correlation coefficient: r = 0.999991, r^2 = 0.999982
Calibration curve: 22961.3 * x + -17.219
Response type: External Std, Area
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None
Compound name: hexaconazole (316)
Correlation coefficient: r = 0.999985, r^2 = 0.999970
Calibration curve: 8583.86 * x + -5759.56
Response type: External Std, Area
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None
y = 8583.86 x－5759.56
y = 22961.3 x－17.219
R2 = 0.9999
R2 = 0.9999
物質名
4000
125000
Response
Response
3000
100000
75000
2000
50000
（SIM測定）
1～20ng/mL
25000
0
0.0
1000
5.0
10.0
15.0
（SRM測定）
0.01～0.2ng/mL
Conc
20.0
0
0.000
0.050
図-2-2 検量線の一例（ヘキサコナゾール）
0.100
0.150
Conc
0.200
テフルベンズロン
フェナリモル
ヘキサコナゾール
プロクロラズ
シクロナイト
ビフェントリン
チフェンスルフロンメチル
添加量
（ng）
50
10
1
2
20
2
5
遮光
回収率
（％）
101
70
84
66
86
75
96
非遮光
回収率
（％）
106
68
79
63
82
80
94
【謝辞】
本検討は、環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課から財団法人
日本食品分析センターに委託された、「平成17年度 化学物質環境実態調
査における分析法開発調査(LC/MS)」の一環として行ったものである。