TRANSKRIPSI

Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si.

Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi UGM

Pengaturan Transkripsi

DNA Perubahan lingkungan RNA Turn on/off gen protein Protein2 untuk menghadapi perubahan lingkungan Sangat penting untuk: 1. Ekspresi gen saat diperlukankan 2. Represi gen saat tidak diperlukan 3. Menjaga sumber energi; menghindari ekspresi gen2 yang tidak diperlukan

Tempat pengaturan : DNA RNA protein

Pengaturan Transkripsi

Transkripsi Initiation Elongation Termination Processing Capping Splicing Polyadenylation Turnover Translasi Protein processing

Transkripsi Prokariotik

• Operons Kelompok gen2 yang saling berhubungan yang ditranskripsi oleh promoter yang sama • RNA polisistronik • Gen2 multiple ditranskripsi sebagai SATU TRANSKRIP • Tidak punya nukleus , shg transkripsi dan translasi dapat terjadi secara simultan

Struktur RNA

      Mengandung ribosa Basa N : A,G,C,U, Urasil berpasangan dengan adenin Secara kimiawi berbeda sedikit dengan DNA, ttp secara struktural mpy perbedaan yang besar Jalin tunggal Kemampuannya untuk melekuk membentuk stuktur 3D  dapat fungsional

Variasi Struktur RNA

  RNA lebih mirip protein dari pada DNA: domain struktur dihubungkan oleh domain yang lebih fleksibel  shg fungsinya berbeda e.g. ribozymes – catalytic RNA

SINTESIS RNA

 RNA polimerase menempel pada DNA, DNA melting  Nucleosida ditambahkan 5’  3’

Jenis RNA

 Messenger RNA (mRNA) – gene2 yang mengkode protein  Ribosomal RNA (rRNA) – membentuk ribosom  Transfer RNA (tRNA) – adaptor yang menghubungkan asam amino amino dg mRNA selama translasi  Small regulatory RNA – disebut juga non coding RNA

Pengaturan Transkripsi

Pengaturan inisiasi biasanya paling penting Transcription Initiation Elongation Termination Processing Capping Splicing Polyadenylation Turnover Translation Protein processing

Inisiasi

   RNA polimerase Faktor2 transkripsi α α β β’σ Promoter DNA   Sisi pengikatan RNAP Operator – repressor binding  TF binding sites lain Start transkripsi : +1

Inisiation

 RNA polymerase   4 subunit Sigma faktor (σ)–    menentukan spesifisitas promoter + σ = holoenzyme Mengikat sekuen promoter Mengkatalisis “open complex” and transkripsi DNA menjadi RNA

RNAP mengikat sekuen promoter spesifik

 Faktor Sigma mengenali sekuen konsensus -10 and -35

Promoter RNA polymerase

TTGACA TATAAT Deviation from consensus -10 , -35 sequence leads to weaker gene expression

Sigma factors

Sigma subunit s 70 RpoD s 54 s S s S RpoN RpoS RpoH s F RpoF s 32 RpoE FecI Type of gene controlled Growth/housekeeping N2; stress response Stationary phase, virulence Heat shock Flagella-chemotaxis Ferric citrate transport # of genes controlled ~1000 ~15 ~100 ~40 ~40 ~5 ~5 E. coli can choose between 7 sigma factors and about 350 transcription factors to fine tune its transcriptional output An Rev Micro Vol. 57: 441-466 T. M. Gruber

Lac operon control

• Repressor binding prevents RNAP binding promoter • An activating transcription factor found to be required for full lac operon expression: CAP (or Crp)

lac operon – activator and

repressor

CAP = catabolite activator protein CRP = cAMP receptor protein

Faktor2 yang mengaktifkan transkripsi

Crp dimer w/ DNA   Helix-turn-helix (HTH) mengikat major groove DNA HTH merupakan salah satu dari banyak TF motif

Pengikatan kofaktor mengubah konformasi  Crp binds cAMP, induces allosteric changes glucose glucose Crp cAMP Crp cAMP lac operon no mRNA mRNA CRP: cAMP reseptor protein/ CAP catabolite gene activator protein

Cooperative binding of Crp and RNAP Pengikatan lebih stabil daripada hanya protein saja

Enhancers

• activating regions not necessarily close to RNAP binding site

NtrC (nitrogen assimilation regulatory protein) example

: • NtrC required for RNAP to form open complex • NtrC activated by P • P NtrC binds DNA, forms loop that folds back onto RNAP, initiating transcription signature of sigma 54

Transcriptional Control

Transcription Initiation Elongation Termination Processing Capping Splicing Polyadenylation Turnover Translation Protein processing

Terminasi Transkripsi

  Bakteri perlu mengakhiri transkripsi pada ujung gen 2 mekanisme terminasi transkripsi pada bakteri:  Rho-independent (lebih umum)  Rho-dependent

Rho-independent termination

• Sekuen terminasi mempunyai 2 ciri : Serial Residu U Daerah kaya GC yang saling komplimen • sekuen kaya GC membentuk loop • Stem-loop menyebabkan RNAP pause • Residu U tidak stabil  rantai RNA dilepaskan

  

Rho-dependent termination

Rho merupakan protein heksamer Melingkupi 70-80 basa RNA Rho mempunyai aktivitas ATPase, bergerak sepanjang RNA sampai sisi RNAP, membuka rantai ganda DNA/RNA hybrid

Transkripsi Eukariotik

• • • Faktor2 transkripsi mengikat daerah

promoter

dari gen.

RNA polymerase II kemudian mengikat promoter untuk memulai transkripsi pada

start site (+1)

.

Enhancers

adalah sekuen DNA dimana faktor transkripsi spesifik (

activators

) terikat untuk meningkatkan laju transkripsi.

26

27

Transkripsi Eukariotik

•

Coactivators

dan

mediators

juga diperlukan untuk fungsi faktor2 transkripsi.

– coactivators and mediators mengikat faktor2 transkripsi dan bagian lain dari komponen/aparatus transkripsi 28

29

Struktur kromosom Eukariotik

• • • • DNA eukariot dikemas dalam chromatin.

Struktur Chromatin berhubungan secara langsung dengan pengaturan ekspresi gen.

Struktur Chromatin mulai dengan organisasi DNA dalam nukleosom.

Nukleosom mungkin memblok RNA polymerase II untuk bergabung dengan promoter.

30

Struktur kromosom Eukariotik

• • •

Metilasi

(penambahan –CH 3 ) pada DNA atau protein histon juga berhubungan dengan pengaturan ekspresi gen.

Kelompok nukleotida sitosin yang termetilasi mengikat protein yang menghambat aktivator untuk binding dengan DNA.

Metilasi pada protein histon berhubungan dengan inaktivasi daerah chromatin 31

32

33

Regulasi post transkripsional

• • Pengaturan ekspresi gen biasanya melibatkan pengaturan inisiasi transkripsi.

Tetapi ekspresi gen dapat dikontrol setelah transkripsi, dengan mekanisme berikut : – RNA interference – alternative splicing – RNA editing – mRNA degradation 34

Posttranscriptional Regulation

• •

RNA interference

molekul small RNA melibatkan pemakaian Enzim

Dicer

memotong double stranded RNA menjadi potongan2 kecil RNA –

micro-RNAs

bind to complementary RNA to prevent translation –

small interfering RNAs

degrade particular mRNAs before translation 35

36

Posttranscriptional Regulation

• • • Introns are spliced out of pre-mRNAs to produce the mature mRNA that is translated.

Alternative splicing

recognizes different splice sites in different tissue types.

The mature mRNAs in each tissue possess different exons, resulting in different polypeptide products from the same gene.

37

38

Posttranscriptional Regulation

• •

RNA editing

creates mature mRNA that are not truly encoded by the genome.

For example – – apolipoprotein B exists in 2 isoforms – one isoform is produced by editing the mRNA to create a stop codon – this RNA editing is tissue-specific 39

Posttranscriptional Regulation

• • Mature mRNA molecules have various half lives depending on the gene and the location (tissue) of expression.

The amount of polypeptide produced from a particular gene can be influenced by the half life of the mRNA molecules.

40

41

Senyawa Penghambat Transkripsi

Actinomycin D



Dari Streptomyces



Mengikat erat pada dupleks DNA menyisipkan diri antara pasangan basa G=C



Menghalangi pergerakan polymerase sepanjang rantai



Menghambat baik prokariotik maupun eukariotik Acridine



Menghambat dengan jalan yang sama dengan Actinomycin D

Senyawa Penghambat Transkripsi

Rifampicin



Dari Streptomyces



Menghalangi pembentukan ikatan fosfodiester pertama



Tidak menghalangi pemanjangan rantai



Mengikat pada sub unit β polymerase RNA



Tidak menghambat sintesis RNA pada eukariot

Senyawa Penghambat Transkripsi

α -amanitin



spesifik inhibitor pada sel hewan



dari jamur Amanita phalloides



menghambat enzim polymerase RNA II pada eukariot



tidak menghambat sintesis RNA prokariot dan jamurnya sendiri