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Biofisicoquímica
Estudio de estructura nativa de
proteínas
Dr. Eduardo Prieto
[email protected]
Dr. Ariel Alvarez
[email protected]
INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA SALUD
UNIVERSIDAD NACIONAL ARTURO JAURETCHE
Av. Lope de Vega 106, Florencio Varela – Buenos Aires – Argentina
Estructura de proteínas
¿Cuáles son las posibles
conformaciones de una proteína?
El estado nativo es metaestable.
El estado conformacional predominante está en equilibrio
con los otros estados.
Degradación
N
Ia
Ib
In
U
 [Urea]
 [Urea]
Agg
Ic
•Nativo (N)
•Desplegado (U o D)
•Parcialmente plegado (MG, I)
Cuerpos de inclusión
(expresión in vivo en E. coli)
Hipótesis termodinámica del plegado proteico
La conformación nativa es la más estable
La proteína adquiere esta conformación
como
resultado
de
restricciones
conformacionales impuestas por la
cadena
principal
y
por
otras
características físicas y químicas de los
aminoácidos
Anfinsen desplegó a la RNasa bajo
condiciones extremas y observó que la
estructura de la enzima SE REPLIEGA
ESPONTÁNEAMENTE en ausencia de
otros factores biológicos externos.
N
U
En 1972 mientras recibe el Nobel
"The native conformation is determined by the totality of
interatomic interactions and hence by the amino acid
sequence, in a given environment."
N
C
C
N
La secuencia de las proteínas o alguna propiedad
relacionada con la secuencia determina la estructura 3D
MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNR
TVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSI
EDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMT
LKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESL
KKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQ
DTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLI
DWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAA
SYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKK
DAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE
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La secuencia de las proteínas o alguna propiedad
relacionada con la secuencia determina la estructura 3D
MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNR
TVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSI
EDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMT
LKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESL
KKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQ
DTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLI
DWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAA
SYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKK
DAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE
-lactamasa
Caracteristicas del Estado nativo (N)
•
•
•
•
•
•
Compactación óptima
Grupos polares en el exterior
Mínima superficie expuesta
Actividad biológica
Interacciones terciarias fijas
Resistente a la acción de proteasas
Ala237: posicionamiento de grupo carbonilo d
anillo -lactámico.
Asn132, Arg244: interacción con sustrato.
Arg244
Ser70
4
3
4
Ala273
1
Ser130
Glu166
Lys73
Glu166: Activación de ser70 para ataque
nucleofílico.
Ser70: ataque nuclofílico al grupo carbonilo de
anillo -lactámico.
Lys73 y Ser130: participan en la formación del
intermediario acil-enzima.
 loop
5
Asn132
El sitio activo de la -lactamasa es una exquisita sonda conformacional, involucra residuos distantes en
secuencia y que adquieren su ubicación espacial con el correcto plegado 3D.
Interacciones del solvente con la
estructura nativa
Human Aldose reductase at 0.66 Å E. Howard
Características del Estado desplegado (U)
•Máxima expansión (aumenta el radio
hidrodinámico promedio)
•Exposición al solvente máxima de las
cadenas laterales. Máxima superficie
expuesta
•En teoría infinitas conformaciones
(random coil)
•Clusters apolares fluctuantes en teoría
sin interacciones preferenciales
•Alta sensibilidad a proteasas
Expansión
Características de los Estados parcialmente
plegados (MG, I)
•Grupo heterogéneo de conformaciones no
nativas
•Estructura residual secundaria, nativa o no
nativa
•Sin estructura terciaria rígida
•Topología variable
•Tendencia a la agregación
•Sensibilidad a proteólisis
Las contribuciones entrópicas
•La diferencia enorme entre el número
de conformaciones permitidas a U y N
•El ordenamiento de las moléculas de
agua sobre la superficie accesible
•La expulsión de moléculas de agua en
el plegado
Las contribuciones entalpicas
•Las interacciones intramoleculares
•Las interacciones con el solvente
•Las interacciones entre moléculas
del solvente.
N
U
Entropía conformacional
Entropía del solvente
Entalpía de solvatación
Entalpía del solvente
•
•
La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N
El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible
•
•
•
Interacciones de van der Waals
Puentes de hidrógeno
Puentes salinos
Cinética del plegado proteico
Escala de tiempo
Side-chain rotations
Loop closure
Protein aggregation
Protein folding
Helix formation
Folding of --hairpins
Cyrus Levinthal (1968-69)
demostró mediante algunos cálculos que si la búsqueda
de la conformación plegada fuera al azar cada molécula
debería atravesar por un número astronómico de
conformaciones desde el estado desplegado.
 Cada aminoácido posee dos posibles conformaciones
 El polipéptido (100 residuos) entonces posee 2100 posibles
conformaciones.
 Damos 1 picosegundo para cada transición entre estados
conformacionales,
El tiempo requerido para el proceso de plegado sería de 1018 segundos o
1010 años.
La búsqueda le tomaría tanto tiempo a la cadena polipeptídica que haría
del plegado un proceso muy poco probable
Paradoja de Levinthal
Sin embargo las proteínas en condiciones adecuadas se
pliegan rápida, espontáneamente y en forma reversible.
N
U
Anfinsen (experimentos con la ribonucleasa)
El plegado es un proceso espontáneo.
Energía
TS
U
N
Coordenada de reacción
Depende solo de la estructura
primaria de la proteína y de las
interacciones con el solvente.
¿Como se puede desplazar el
equilibrio?
Osmolitos
Caotropos
● Sulfato de sodio
● Urea
● TMAO
● Cloruro de guanidinio
● Tiocianato de guanidinio
Energía
Estado desplegado
Estado nativo
[D]
¿Como hacemos para determinar la
cantidad de proteína nativa?
Desplegado en el equilibrio
[U]
ku
N
kf
U
[N]
=
ku
kf
= K NU
G NU = - RTln K NU
ΔGNU  ΔGN0 U  m[D]
0  ΔGN0 U  m[C m]
[GdmHCl]
ΔGN0 U / m  [Cm]
Cm
[GdmHCl] (M)
ΔGN0 U
m
0
1
2
3 4
5
6
[GdmHCl] (M)

U
K
N 
1  f N  fU
[D] = Cm
G NU  RT ln K
G NU

U  fU
K

N
N  f N
0.5  f N  fU
G NU

 ln K
RT
e

ku
kf
G  NU
RT
U
K

N
  RT ln
U 
G NU  GH2O NU  mNU D
e

G  H 2O
NU
RT
 m D 
K
Stotal
e

S N  SU K

1  K 
G  H 2O
NU
RT
 m D 
K
¿Como nos damos cuenta de
equilibrios intermedios?
Estructura terciaria:
CD en el UV cercano,
fluorescencia,
actividad enzimática
Estructura secundaria:
CD en el UV lejano
Compactación:
SEC-FPLC, DLS
(RS)
Estados parcialmente plegados en
equilibrio con la forma nativa
El plegado es un proceso espontáneo.
Modelos de plegado: Nucleación
Modelos de plegado: Difusión, colisión y
coalescencia
Modelos de plegado: El modelo jerárquico
Modelos de plegado: El modelo del
rompecabezas.
Modelos de plegado: El colapso hidrofóbico
Embudos conformacionales y paisajes
energéticos.
Cinética de plegado
Fluorescencia (U.A.)
600.00
500.00
400.00
300.00
200.00
Energía
100.00
A
B
0
100
200
300
Tiempo (S)
400
500
600
Replegado
50.05 M GdmCl, 20 C
Actividad -lactamasa
t1/2(ES-LC9) = 408 min
t1/2(ES-L) = 1.2 min
SEC-FPLC
t1/2(ES-LC9) = 398.5 min
6 M GdmCl → 0.05 M GdmCl
Dos proteínas con el mismo fold. Una dos
estados y otra tres estados?
Lisozima
-lactalbumina