Transcript presentasi papain

Isolasi Papain dan
Karakterisasi Biokimia
Michelle 10509016
Surya 10509002
Gaby Almira 10509028
Enzim Papain
• Enzim papain merupakan enzim proteolitik yang dihasilkan
dari isolasi penyadapan getah buah pepaya (Carica papaya, L.)
Kegunaan dari papain:
 Dalam industri makanan dan minuman :
- pelunak daging
- stabilizer dalam pembuatan jelly
- pengental dalam pembuatan sirup sari buah
- penggumpal susu dalam pembuatan keju
 Dalam bidang farmasi:
- pelancar pencernaan
- luka infeksi
- mengurangi penggumpalan darah sebelum operasi
Tujuan
Menentukan nilai Vmaks dan Km
dari enzim papain
Menentukan aktivitas enzim papain
Pepaya
Getah pepaya mengandung tiga jenis enzim, yaitu
enzim papain, kimopapain dan lisozim.
• Keistimewaan enzim papain
 Mempunyai kestabilan yang baik pada larutan
yang mempunyai pH 5.0
 Memiliki keaktifan daya tahan panas yang
lebih tinggi dari enzim lain
 Tidak bersifat toksik
 Tak ada reaksi samping
 Dapat bekerja dengan baik pada konsentrasi
rendah
Alat dan Bahan
• Alat :
–
–
–
–
–
–
–
Gelas kimia
Tabung reaksi
Inkubator 500C
Batang pengaduk/vortex
Spektrofotometer
Stopwatch
Freezdryer
Bahan :
- Buah pepaya muda
- Akuades
- Aseton
- Bufer fosfat 0,1pH 7,0
- Kasein 2%
- L-sistein 0,1 M
- Asam trikloro asetat
- Standar Tirosin 1 mg/mL
Pengujian aktivitas enzim papain
(Metode Murachi)
 Inkubasi t = 20 menit
Kasein
L-sistein
Inkubasi 20
menit
bufer fosfat
(500C)
Inkubasi
5 menit
(500C)
+ papain
Sentrifugasi
10 menit
Fitrat
+ TCA
20%
Inkubasi
20 menit
(500C)
Ukur
absorbansi
(280 nm)
Metode murachi
Inkubasi t = 0 menit
Inkubasi
20 menit
(500C)
Sentrifugasi
10 menit
L-sistein
bufer fosfat
papain
+ kasein
+ TCA 20 %
Inkubasi
20 menit
(500C)
Fitrat
Ukur
absorbansi
(280 nm)
Data Pengamatan
Absorbansi Larutan Sampel
Absorbansi Larutan Standar Tirosin
[Tirosin]
(µg/mL)
Absorbansi
40
0,235
80
0,496
120
160
0,609
0,815
Tabung
Absorba
Tabung
Absorba
(t = 0)
nsi
(t = 20)
si
1
0
1
0,323
2
0
2
0,493
3
0
3
1,277
4
0
4
1,672
5
0
5
1,669
Pengolahan Data
Kurva Standar tirosin
dari persamaan garis
y = 0,0046 x + 0,0755 substitusi
absorbansi maka diperoleh
0.9
0.8
Tabu
y = 0,0046x + 0,0755
R² = 0,9791
0.7
ng (t
= 0)
0.6
0.5
Absorban
si0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
50
100
[Tirosin] (µg/mL)
150
200
[Tirosi
n]kontrol
(µg/m
L)
Tabun
g (t =
20)
[Tirosi
n]sampel
(µg/m
L)
1
0
1
53,80435
2
0
2
90,76087
3
0
3
261,1957
4
0
4
347,0652
5
0
5
346,413
Pengolahan Data
( Penentuan Aktivitas Papain)
Tabung
A
I
0,323
53,80434783
II
0,493
90,76086957
III
1,277
261,1956522
IV
1,861
388,1521739
1,672
347,0652174
V
 Unit aktivitas protease = 𝜇𝑔 𝑡𝑖𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛
 m Tirosin =
20 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
𝜇𝑔
53,80434783 𝑚𝐿 . 3 𝑚𝐿 (𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒
161,4130435𝜇𝑔
 Unit aktivitas protease=
𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
𝑚𝐿 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚
[ Tirosin] ppm
0,5 𝑚𝐿
𝑐𝑎𝑚𝑝𝑢𝑟𝑎𝑛) = 161,4130435 𝜇𝑔
=16,14130435 𝜇𝑔/𝑚𝐿/
20 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡
Aktivitas papain
Tabung
[ Tirosin]
ppm
I
53,80434783
161,4130435
16,14130435
II
90,76086957
272,2826087
27,22826087
III
261,1956522
783,5869566
78,35869566
IV
388,1521739
1164,456522
116,4456522
V
347,0652174
1041,195652
104,1195652
Penentuan Vmaks dan Km
[Tirosin] = [Tirosin]sampel - [Tirosin]kontrol
[𝑻𝒊𝒓𝒐𝒔𝒊𝒏]µ𝒈/𝒎𝑳
𝑽𝟎 =
𝟐𝟎 𝒎𝒆𝒏𝒊𝒕
Tabu
[Tirosin]kontr
[Tirosin]samp
ng
ol (µg/mL)
el (µg/mL)
1
0
53,80435
53,80435
2,690217
2
0
90,76087
90,76087
4,538043
3
0
261,1957
261,1957
13,05978
4
0
347,0652
347,0652
17,35326
5
0
346,413
346,413
17,32065
[Tirosin]
V0
(µg/mL/menit)
Penentuan Nilai KM dan Vmax
Berdasarkan Kurva Lineweaver-Burk
[ kasein ] =
𝟐×𝟏𝟎𝟔 µ𝒈×𝑽𝒌𝒂𝒔𝒆𝒊𝒏 (𝒎𝑳)
𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 ×𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 (𝒎𝑳)
Kurva Lineweaver-Burk Kasein
0.4
y = 199.42x + 0.0272
R² = 0.9873
0.35
[Kasein] (µg/mL)
V0
1/[kasein]
1/V0
570,6
2,690217
0,001753
0,371717
0.25
1139,6
4,538043
0,000878
0,220359
1/v 0.2
2841
13,05978
0,000352
0,076571
0.15
5638
17,35326
0,000177
0,057626
0.3
0.1
0.05
11100
17,32065
9,01E-05
0,057735
0
0
0.0005
0.001
1/[kasein]
0.0015
0.002
Nilai Vmaks dan Km
• Dari kurva diperoleh persamaan garis y = 199,42x + 0,0277.
Berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk;
•
1
𝑉
=
𝐾𝑀 1
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
+
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
• Maka dapat ditentukan V max dan KM sebagai berikut:
•
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 0,0277
• 𝑽𝒎𝒂𝒙 =
•
𝐾𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝟏
𝟎,𝟎𝟐𝟕𝟕
= 𝟑𝟔, 𝟏𝟎𝟏𝟎𝟖𝟑
= 199,42
• 𝑲𝑴 = 𝟏𝟗𝟗, 𝟒𝟐 𝒙 𝟑𝟔, 𝟏𝟎𝟏𝟎𝟖𝟑 = 𝟕𝟏𝟗𝟗, 𝟐𝟕𝟕
Kurva michaelis menten
20
16
12
V
8
4
0
0
2000
4000
6000
[kasein]
8000
10000
12000
Pembahasan
Fungsi reagen
• Kasein : substrat
• L-sistein : aktivator
• Buffer posfat : menjaga pH optimal
• TCA : menghentikan aktivitas enzim
Inkubasi
T= 0 -> blanko
T= 20 -> sampel
Reaksi Hidrolisis
Thanks... ^^