Transcript 紫外吸收光谱图

课程要求：
• 每次课后都要做1~2题与上课内容相关的练习，
学委按学号排好，交到研究生助理师兄师姐处。
课程成绩
• 期末笔试60%，平时成绩40%
• 平时成绩：两次实验报告分数平均20%，课后
练习20%。（17次练习总评）。
• 联系方式：
黄思齐：13570564914
郑绮姗：18998498620
第十章 紫外-可见分光光度法
Ultraviolet Spectrophotometry, UV
基本要求
1. 了解紫外—可见吸收光谱产生的原理
2.了解紫外—可见吸收光谱仪基本构成部
件及其作用
掌握紫外—可见吸收光谱用途
3.掌握紫外吸收光谱在有机化合物结构解
析方面的应用
4.掌握紫外—可见吸收光谱在定量分析方
面的应用
第一节
紫外光谱产生原理
物质的吸收光谱
光的波粒二象性
波动性：λν= c
粒子性：E = h ν
物质对光的选择性吸收
M(基态) + h
→
M*(激发态)
吸光
M(基态) + h
←
M*(激发态)
发光
当电磁辐射的能量 hν=E1-E0,与物质的某种能
级相等时，物质吸收光能后发生能级跃迁。
电磁辐射与物质的相互作用-常用光谱分析法分类
紫外光谱技术：基于紫外光与物质相互
作用，使紫外光信号发生改变，再根据
信号的改变对物质进行分析的技术。
紫外光谱产生原理
紫外-可见吸收光谱是基于分子外层价电子跃迁
产生的吸收光谱，与分子电子结构紧密相关。
E（ * ）
<150 nm，远紫
外光谱（烷烃）
E （n*） 约
170-180 nm （含
杂原子烷烃，
n* 约220～
250 nm， S，I）
紫外: 200～380 nm，可见光: 380～760 nm
4
Beer-Lambert 定律----吸收定律
A = -log(I / I0) = e c l
•
•
•
•
•
•
e = 摩尔消光系数
c =摩尔浓度
l =比色池长度
A，吸光度
I ，透射光的强度
I0，入射光的强度
紫外光谱的吸收与吸光物质的量有关
8
第二节
紫外-可见分光光度计的基本结构
紫外-可见分光光度计的基本结构
光源
单色器
吸收池
检测
系统
记录显示
系统
• 光源
可见光区常用钨丝灯，发射波长（325—2500）范
围，其中最适用范围320—1000nm。紫外光区光源常用
气体放电光源，如氢、氘放电灯，发射光谱波长
190 —400nm，最适宜使用范围180—350nm。
寿命:500～800h，
少数达2000h
开关次数与其正常
使用时间成反比。
最好在需要关灯4小
时以上才关灯。
点亮后须要30分钟
左右的稳定时间。
•单色器
使光源发出的光变成所需要的单色光
•吸收池
• 紫外及可见分光光度法中，一般使用液体试样。盛
放试液的液体池。
• 试样放在分光光度计光束通过的光路上。
• 可见光区用玻璃吸收池，400nm～2000nm
• 紫外光区用石英吸收池, 180nm～3000nm:液体池、
气体池、微量池（容积5μl～1ml）、流动池、长
光径池（测量稀溶液用）
•检测器
• 光电倍增管，
• 二极管阵列作为检测器。
分光光度计类型
• 单光束分光光度计
• 双光束分光光度计
一次测量即可得到样品溶液的吸光度，可以连续
地绘出吸收光谱曲线，可以消除光源强度变化带
来的误差。
分光光度计类型
•
双
波
长
分
光
光
度
计
通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测
得吸光度差A。 ∆A =Aλ1-Aλ2
A  lg
I 1
I 2
 A2  A1  (e 2  e 1 )bc
优点：测定高浓度、多组分混合试样,测定浑浊试样
第三节 分子结构与紫外吸收光谱
紫外吸收光谱在定性分析中的应用
紫外光图的特点：带状光谱
T ：
65% ~ 20%
A：
0.2 ~ 0.7
11
紫外吸收光谱图
•紫外光谱特性常数：
吸收波长（λmax），强
度（ε max ），
•书写方式：
UV (MeOH): λmax
230(ε 11，600) nm
名词解释
A
末端吸收
最强峰
肩
峰
峰谷
max
T ：
65% ~ 20%
A：
0.2 ~ 0.7
次强峰
 min

名词解释
•
•
•
•
•
•
红移： 最大吸收波长向长波方向移动
兰移： 最大吸收波长向短波方向移动
增色效应：使吸收强度增大的效应
减色效应：使吸收强度减小的效应
发色团
助色团
分子结构与紫外吸收光谱
•不产生紫外吸收的有机化合物
饱和有机化合物
R-H,R-X
• *
• n *
• 烷烃：max<190 nm
甲烷125 nm，乙烷135 nm
• 醇、醚、含氮、含硫化合物及卤代物
硫醚、醇 n*跃迁吸收波长~210 nm
25
•产生紫外吸收的有机化合物
ΔE （π→π*）约160-190 nm
π键共轭吸收波长红移至近紫外区及可见光区
ΔE （n→π*）（含有C＝O，C=S，N＝O）吸收
波长范围在近紫外 270～290 nm
发色团：产生紫外吸收及可见光吸收的基团
C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—
N=O; C=S; C≡C; N≡C; X=C=Y
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烯烃、炔烃和共轭二烯烃及其衍生物
• 非共轭烯*跃迁<190 nm
乙烯165nm(e 15000)
• 共轭体系延长，  max 向长波方向移动，
且出现多条谱带, e增加
• H-(CH=CH)n-H, n=8时 max在可见光区
• π→π*跃迁特点：ε >104
羰基化合物 C＝O C=S紫外吸收光谱
• 醛、酮类化合物
C＝O
n*跃迁( R ),
max270～300 nm,
e100, 呈 平 滑 带
形，对称性强
33
芳香族化合物紫外吸收光谱
• *跃迁，
• B带：230-270 nm，中
等强度，精细结构为苯
的特征谱带
• E1 带180-184 nm，一般
在远紫外光谱区
• E2 带200～204 nm，强
吸收带,观察不到其精细
结构
41
结构与紫外吸收的关系
无紫外吸收
* 跃迁
n* 跃迁
max < 200 nm
产生紫外吸收
*跃迁
键共轭
n*跃迁
及共轭体系
max >200 nm
max > 270 nm E1带
180-184 nm，
eMax<10 0
emax ≥104
emax ≥104
E2带
K带
芳环多条谱带
*跃迁
E2带
200～204 nm
R带
emax > 1,000
B带
> 250 nm，有精
饱合化合物
共轭烯
羰基化合物
细结构
e max > 200
影响吸收带的因素
电荷转移络合物
• 富电子( donor, D分子)和缺( acceptor, A分子)的2种
分子形成的一类络合物。电荷转移复合物的形成分
子吸收辐射后,分子中的电子从给体最高占有轨道向
受体最低空分子轨道跃迁而发生电子能量吸收,这种
跃迁称为电荷转移,由这种迁移引起的反应称为荷移
反应,其产物为CTC。εmax >104 l/mol.cm
• a阿司咪唑, b四氰基乙烯
影响紫外吸收的结构因素
助色团取代：本身不产生紫外及可见光吸收，
但与生色团相连时，使生色团的吸收向长波
方向移动,且吸收强度增大
-OH，-OR，—NH—，—NR2—，-X， -SH、
-Cl, -Br, -I
不同助色团的红移顺序为： NH3+ < CH3 <
Cl，Br < OH < OCH3< NH2< O有公式可以定量计算
19
 烯碳上烷基取代基含孤对电子取代基数目增加，
max红移
(CH3)2C=C(CH3)2，max197 nm(e 11500)
 助色基团使n→π*跃迁的吸收带蓝移
E
¦Ð3*
¦Ð *
¦Ð *
¦Ð*
¦Ð
¦Ð
n
n
n
n
¦Ð2
¦Ð
¦Ð
O
¦Ð1
O
Br
Br
28
O
O
R
助色基与苯相连，产生p-共轭，使E2带、B
带 max 均红移，B带吸收强度增大，精细结
构消失
B
E
OH
270 (1450)
211
287 (1450)
235 (9130)
257 (170)
210 (750)
NH2
Cl
44
254 (250)
204 (7900)
不同生色团的红移顺序：
SO2NH2<COO-，
CN<COOH<COCH3<CHO<Ph<NO2
• 苯与生色基团C=C、C=O、N=O共轭，在200～250
nm出现E2 (K带e >104),，B吸收带产生较大红移
46
• 稠环芳烃，B带,E2带红移
52
•隔离效应：非共轭双键不会影响吸收带
的波长（CH2有隔离效应）
C C CH2 C C
58
介质对紫外吸收的影响
溶剂极性增加， K带移向长波，R带移向短波
61
溶液的酸碱性
pH值可影响物质存在形式，影响吸收波长
O
OH
+
-
OH
-
紫外吸收光谱在结构解析中应用
• 紫外光谱的结构信息：谱图简单，只有一、
二个吸收峰
70
确定有机化合物构型
紫外吸收光谱在定性分析中应用
• 目的是要鉴定出待分析化合物是什么化合物
• 做法：吸收光谱的形状
吸收峰的数目
吸收峰的位置（波长）
吸收峰的强度
相应的吸光系数
完全一样
（在同样条件下：浓度，比色池厚度）
对比吸收光谱的一致性
比较λmax、ε(εmax)
看出化合物的区别
消光系数不同
药典上的用法：维生素B12 的吸收曲线
分别在278nm、361nm 和550nm 波长处有三个
吸收峰，可通过它的吸收光谱的特征，利用其
特征吸收值之间的比值A361/A278 和
A361/A550 进行定性鉴别，并了解维生素B12
的纯度。
药典规定VB12定性鉴别：
278 ，361 ，550三处最大吸收
A361
A361
 1.70 ~ 1.88 ，
 3.15 ~ 3.45
A278
A550
第四节
紫外吸收光谱在定量分析中的应用
Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律
I
 Lamber  Beer定律表达式  lg
 E C l
I0
I
透光率 T 
I0
或 T  10  A  10  ECl
吸光度 A   lg T  E  C  l

描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测
物浓度的关系
E：吸光系数

摩尔吸光系数意义：
ε=f（物质性质，温度，溶剂，λ）
•当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）
•不同物质在同一波长下ε可能不同（与吸收
的跃迁几率、分子的截面积有关）
•同一物质在不同波长下ε一定不同
•ε↑，物质对光吸收能力↑, 定量测定灵敏
度↑
根据ε大小可区分峰强弱：ε> 104强吸收 ，
103～104较强吸收，102～较弱吸收，ε<10
弱吸收 .
•在同一波长下，各组分吸光度具有加和性

吸光系数两种表示法：
1）摩尔吸光系数ε：
在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度
2）百分含量吸光系数 / 比吸光系数：
在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度
3）两者关系
M
1%
e   E1cm
10
偏离吸收定律的因素

化学因素的影响：
解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律
产生偏离
强酸性条件下测量酸型，可消除影响
偏离吸收定律的因素
非单色光对比尔定律产生偏离
（E2  E1）C l
I 01  I 02 10
 A   lg T  E1C  l  lg
I 01  I 02
Ø
透光率的测量误差——ΔT
C 0.434 T
浓度的相对误差

C
T  lg T
 lg T  0.434 ，T  36.80%
 对应最小的测量误差
适宜的浓度范围：T ：65% ~ 20%，A ：0.2 ~ 0.7
Ø
吸光度测量的条件选择：
1）测量波长的选择：λmax
2）吸光度读数范围的选择：A=0.2~0.7
3）参比溶液(空白溶液)的选择：
采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和
界面反射等因素对透光率的干扰
有一化合物在乙醇溶液中的λmax为240nm，其ε为
1.70×104，摩尔质量为314.47.试问配什么样的浓度
测量最合适。
A=0.434= εC
浓度分析方法
•
吸光系数法（绝对法）
方法：W ( g )样(含i) 
 C ( g / mL)  求A  Ci
稀释
A
A
Ci [ g / 100mL] 
或Ci [mol / L] 
E l
e l
Ci
i% 
100%
C样
Ei已知
ü
对照法：外标一点法
C
前提：固定仪器和测定条件；
截距为0 ；
Cs
标样与样品浓度相近
Ci
方法：一定  分别测定A样和A标
Ai
Ci  C S 
AS

注：当样品溶液与标准品溶液稀释倍数相同时
Ai
mi  mS 
AS
mi
i% 
 100 %
m
ü
标准曲线法
固定仪器和测定条件
A  K C  A  C
方法：配制标准系列  
 分别测定A  C ~ A曲线
固定条件
样品  
 测定Ai  查得Ci
同上条件
Ci
i% 
100%
C样
Ø
多组分的定量方法
定量依据：A总  Aa  Ab  Ac  
两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）
两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量
过程：1  测定E1a ；A1a

b
2  测定E2
b
；A2
由A1a  E1a  C a  C a 
由A2b  E2b  Cb  Cb 
A1a
E1a
b
A2
E2b
两组分吸收光谱部分重叠
λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Ca
λ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca
ü
过程：1  测定E1a ；A1a
2  测定E2a 和E2b ；A2a b
由A1a  E1a  C a  C a 
a b
由A2

a
A2

 Cb 
b
A2
a
 E2
a
A1
a
E1
b
 Ca  E2
A2a b  E 2a  C a
Eb
 Cb
ü
两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定
（1）解线性方程组法
（2）等吸收双波长消去法
(3)导数光谱法
解线性方程组法
a
b
a b


测定
E
和
E
；
A
1
1
1
方法： 1
 2  测定E 2a 和E 2b ；A2a b
A1a b  E1a  Ca  E1b  Cb
A2a b  E2a  Ca  E2b  Cb
 Ca 
Cb 
A1a b  E 2b  A2a b  E1b
E1a  E 2b  E 2a  E1b
A2a b  E1a  A1a b  E 2a
E1a  E 2b  E 2a  E1b
等吸收双波长法

a b
a
b
A

A

A
1
1
方法： 1
A2a  b  A2a  A2b
Aa b  A1a b  A2a b  ( A1a  A2a )  ( A1b  A2b )  Aa  Ab

消除a的影响测b
选 a 的等吸收点1和2  A1a  A2a
 Aa b  A1b  A2b
 ( E1b  E2b )  Cb
 Eb  Cb
A a b
A a b
 Cb  b

b
E1  E 2
E b

消去b的影响测a
选 b 的等吸收点1' 和2'  A1b'  A2b'
 Aa b '  A1a'  A2a'
 ( E1a  E2a )  Ca
 Ea  Ca
A a b '
A a b '
 Ca  a

a
E1'  E 2'
E a

•
•
注：须满足两个基本条件
选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点
选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大
导数分光光度法
把吸收光谱看做波长的函数，
A  elc  e  c
其的导函数图像就是导数光谱
dI
de
d A
d e

Ilc ,
 cl
n
d
d
d
dn
n
n
一阶导数信号与浓度成正比。
二阶、三阶….n 阶导数信号亦与浓度成正比。
特点：解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除
胶体等散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率。
导数吸光度光谱绘制
•人工作图法：从吸收光谱的数据中每隔一个波
长小间隔Δλ（1～2nm），逐点计算出
ΔA/Δλ的值，利用这些数值对波长描绘成图
像，就得一阶导数光谱。用类似方法又可从导
数光谱中获得高一阶的导数光谱。
 A  Ai 1  Ai
 
  i i 1  i
• 仪器扫描法：用双波长分光光度计以固定
Δλ（1～2nm）的两束单色光同时扫描，
记录样品对两束光吸光度的差值ΔA，便
得到样品的一阶导数光谱。
• 装有微处理机的分光光度计，利用它的记
忆和处理数据的功能，可直接存储吸收光
谱的数据并加以处理，可描述一阶、二
阶……等各阶的导数光谱。
•导数峰高测量方法如下图：
正切法：相邻峰(极大或极小)切线中点至相
邻峰切线(极小或极大)的距离d；
峰谷法：两相邻峰值(极大或极小)间的距离
p 1或p 2；
峰零法：极值峰至零线间的距离z。
一阶导数光谱法测定阿达帕林脂质体中药物含量
阿达帕林的光谱曲线在279 nm处有一较大的峰-谷位值,
而空白脂质体在此波长的光谱曲线与基线重合,故采用
279 nm处一阶导数峰-谷值(零谷值D )对阿达帕林测定
一阶导数光谱法测定阿达帕林脂质体中药物含量
• 制备浓度为6.12, 12.24, 18.36,30.60,
36.72μg·mL-1的系列溶液。
• 以含12%四氢呋喃的甲醇溶液为空白,用一阶
导数法测定上述阿达帕林溶液在279 nm处的
“零谷值”D,分别为0.0325,0.0642, 0.096
4, 0.1289, 0.1604, 0.1892。
• 以阿达帕林浓度(C,μg·mL-1 ) ～“零谷
值”D 作工作曲线,得回归方程为:D = 0.
0052C + 0.0015, r = 0.999 7 ( n =3)。