Transcript Computational Biology

1 Protein-Netzwerke: topologische Graphen-Netzwerke
2 Analyse von Stoffwechselwegen (metabolic pathways):
Konzentration auf Metabolite, enzym. Reaktionen
3 Zell-Simulationen: dynamische Simulation auf
Sekunden-Zeitskala, t = 0.01 s (V10 und V11)
Systembiologie: Integration von genomischen und
proteomischen Analysen
Komplexität, Level an Verständnis
Bereich 3: V10 - Integrative Biologie
www.systemsbiology.org
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1
Analyse von Stoffwechselwegen: Beispiel E. coli
verwende Daten aus Datenbank EcoCyc
(siehe auch MetaCyc: Stoffwechsel von > 150 Organismen)
EcoCyc enthält 905 Reaktionen für E.coli
davon gehören 161 nicht zum Stoffwechsel kleiner Moleküle, z.B. DNA Replikation,
von den verbleibenden 744 wurden 569 mindestens einem Pfad zugeordnet
Dagegen gibt es 607 Enzyme.
Es gibt also keine 1:1 Zuordnung zwischen Enzymen und Reaktionen, denn
(1)
Manche Enzyme katalyiseren mehrere Reaktionen,
und manche Reaktionen werden von mehreren Enzymen katalysiert
(2)
nicht zu allen Reaktionen sind die Enzyme bekannt, die sie katalysieren.
Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)
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2
Beispiel: Stoffwechsel von E. coli
Die 744 Reaktionen enthalten
791 verschiedene Substrate.
Im Mittel enthält jede Reaktion
4 Substrate.
Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)
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Beispiel: Stoffwechsel von E. coli
EcoCyc enthält 131 StoffwechselPfade.
Die Länge der Pfade variiert von
1 bis 16. Im Mittel 5.4.
Von den 607 Enzymen sind
100 multifunktional.
Purin-Nukleosid-Phosphorylase
und Nukleosid-Diphosphatkinase
katalysieren 7 bzw. 9 Reaktionen.
483 Reaktionen gehören zu einem
Pfad, 99 Reaktionen gehören zu
mehreren Pfaden.
Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)
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Fazit
Stoffwechsel-Netzwerke von einfachen Organismen sind mittlerweile
fast vollständig bekannt.
Ist die Beschreibung mit einzelnen Stoffwechsel-Wegen adäquat?
- Reaktionen, Enzyme und Substrate gehören oft zu mehreren Pfaden.
- Die Einteilung in einzelne Stoffwechsel-Pfade ist nicht immer eindeutig.
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Protein-Netzwerke: Cytoscape
Main window of Cytoscape 2.0,
displaying a network of proteinprotein and protein-DNA
interactions among 332 yeast
genes.
http://www.cytoscape.org/
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Protein-Wechselwirkungsnetzwerke: Cytoscape
You can flip through different
visual styles by making a
selection from the Visual Style
pull down menu. "Sample2" will
give gene expression values
for each node will be colored
along a color gradient between
red and green.
http://www.cytoscape.org/
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Protein-Wechselwirkungsnetzwerke: Cytoscape
With the Cytoscape Visual
Style feature, you can easily
customize the visual
appearance of your graph.
Cytoscape can also map
values such as probabilities,
confidence levels, and
expression values to the
visualization of networks.
http://www.cytoscape.org/
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Protein-Wechselwirkungsnetzwerke: Cytoscape
Cytoscape implements an algorithm for
finding "active pathways", i.e., subnetworks
of genes that jointly show significant
differential expression over a set of
experimental conditions observed by
microarray experiment. The image right
show the results of a run of this algorithm.
Several active paths have been found; the
highest scoring one has 22 genes identified
as being active in three of the 20
experimental conditions. From here, one
can view a graph with only these genes,
display the expression data for any of the
conditions, and examine Gene Ontology
(GO) information available to assess the
biological significance of this network.
http://www.cytoscape.org/
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Features of Cytoscape v2.0 (July 2004)
Input
Input and construct molecular interaction networks from raw interaction files (SIF
format) containing lists of protein-protein and/or protein-DNA interaction
pairs. For yeast and other model organisms, large sources of pairwise
interactions are available through the BIND and TRANSFAC databases.
User-defined interaction types are also supported.
Load and save previously-constructed interaction networks in GML format (Graph
Markup Language).
Input mRNA expression profiles from tab- or space-delimited text files.
Load and save arbitrary attributes on nodes and edges. For example, input a set
of custom annotation terms for your proteins, create a set of confidence
values for your protein-protein interactions.
Import gene functional annotations from the Gene Ontology (GO) and KEGG
databases.
http://www.cytoscape.org/
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Features of Cytoscape v2.0 (July 2004)
Visualization
Customize network data display using powerful visual styles.
View a superposition of gene expression ratios and p-values on the
network. Expression data can be mapped to node color, label, border
thickness, or border color, etc. according to user-configurable colors and
visualization schemes.
Layout networks in two dimensions. A variety of layout algorithms are available,
including cyclic and spring-embedded layouts.
Zoom in/out and pan for browsing the network.
Use the network manager to easily organize multiple networks.
Use the bird’s eye view to easily navigate large networks.
http://www.cytoscape.org/
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Features of Cytoscape v2.0 (July 2004)
Analysis
Java plug-ins available for network and molecular profile analysis. E.g.:
Filter the network to select subsets of nodes and/or interactions based on the
current data. E.g., users may select nodes involved in a threshold number of
interactions, nodes that share a particular GO annotation, or nodes whose gene
expression levels change significantly in one or more conditions according to pvalues loaded with the gene expression data.
- Find active subnetworks / pathway modules. The network is screened against
gene expression data to identify connected sets of interactions, i.e. interaction
subnetworks, whose genes show particularly high levels of differential
expression. The interactions contained in each subnetwork provide hypotheses
for the regulatory and signaling interactions in control of the observed
expression changes.
- Find clusters (highly interconnected regions) in any network loaded into
Cytoscape. Depending on the type of network, clusters may mean different
things. For instance, clusters in a protein-protein interaction network have been
shown to be protein complexes and parts of pathways. Clusters in a protein
http://www.cytoscape.org/
similarity network represent protein families.
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Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära
(a) klassische Biochemie
bestimmt Stöchiometrien
einzelner Reaktionen
(b) Katalogisierung vieler
Reaktionen, Gruppierung nach
gemeinsamen Metaboliten führt
zu traditionellen Pfaden wie
Glykolyse, Pentose-PhosphatPfad
(c) Durch komplette Information
können nun die kompletten
metabolischen Pfade zugeordnet
werden.
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Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära
Traditionelle metabolische Pfade dienen als konzeptioneller Rahmen
für Forschung und Lehre.
Man kann dadurch Metabolismen verschiedener Organismen vergleichen.
Jedoch sind sie nicht für quantitative, systemische Bewertungen biologischer
Reaktionsnetzwerke geeignet, da sie nur Teile der Netzwerke darstellen.
Sie wurden oft in Zelltypen entdeckt, in denen sie wichtige metabolische
Funktionen übernehmen (z.G. Glykolyse in Hefe).
Man kann diese Pfade jedoch nicht einfach auf andere Zelltypen mit anderen
Enzymleveln und metabolischen Profilen übertragen.
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3 Vorgehensweisen
1
konstruiere alle Transformationswege, die von einem gegebenen
Substrat zu einem gegebenen Produkt führen
2
verwende Satz von linear (systemisch) unabhängigen Basisvektoren
im Raum der Reaktionsflüsse, durch Linearkombination sollen sich
alle möglichen Flußverteilungen darstellen lassen.
Allerdings ist die Wahl dieser Basisvektoren nicht eindeutig.
3
Konzept der elementaren (Fluss-) Moden
Eine Elementarmode ist ein minimaler Satz von Enzymen, die im
Gleichgewicht operieren können. Minimal heisst: falls nur die
Enzyme dieser Mode operieren, führt Inhibition jedes einzelnen
seiner Enzyms zum Stop aller Gleichgewichtsflüsse im System
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Beschreibung vernetzter metabolischer Pfade
Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)
(a) aus genomischen, biochemischen, physiologischen Daten wird ein
Reaktionsnetzwerk aufgestellt. Es gibt interne Flüsse innerhalb der
Systemgrenzen und externe Flüsse mit der Umgebung.
(b) Dieses Netzwerk wird durch eine stöchiometrische Matrix dargestellt,
in der Metaboliten durch Reaktionen miteinander verbunden werden.
(c) Mögliche Zustände der Zelle aufgrund dieser Matrix werden mit
Techniken wie „elementary modes“ oder „extreme pathways“ identifiziert.
Die möglichen Zustände liegen innerhalb eines Konus im durch die
verschiedenen Flüsse aufgespannten Koordinatensystem.
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Analyse der stöchiometrischen Matrix
stöchiometrische
Darstellung des Reaktionsnetzwerks mit stöchiometrischer Koeffizienten der
einzelnen
Matrix S.
Reaktionen.
Metabolite
Analyse der Matrix S 
Pathway-Darstellung P.
Deren Zeilen enthalten
den Reaktionen
entsprechende Flüsse
und die Spalten die sich
ergebenden Pfade.
Darstellung der
Pfade ist möglich
für einfache
Netzwerke.
Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)
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Netzwerk-Analyse
(a) welche Substrate (A-E) sind zur
Produktion der Biomasse erforderlich
(B,E), welche nicht?
(b) Aufspüren von nicht genutzten
Reaktionen (F  E), Refinement
der Annotation von Genomen.
Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)
(c) quantitative Beschreibung von
Pathway-Redundanz bzw. Robustheit
des Netzwerks: P1 und P2 führen beide
von A nach D.
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(d) Reaktionen RA, RB und RC werden
stets gemeinsam benutzt. Ihre Gene
werden daher vermutlich koordiniert
reguliert.
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Welche Rolle spielt Pathway-Analyse?
Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)
Die auf Netzwerken basierende Analyse von Pfaden stellt eine gute Basis dar
um die heutige Flut an experimentellen Daten ohne vorgefasste Meinungen
in biologische Modelle zu übersetzen.
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konkretes Beispiel:
Glykolyse
Stoffwechselpfad
in Lehrbuch.
http://biotech.icmb.utexas.edu/
glycolysis/pathway.html
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Glykolyse
Pyr
Pyk
PEP
Schematische Darstellung.
Metabolite sind blau,
Enzyme rot dargestellt.
Eno
2PG
Gpm
3PG
Pgk
Gap
Glucose
Hexokinase
G6P
F6P
Pgi
FP2
Pfk
GAP
1,3BPG
Fba
TpiA
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DHAP
21
Pentose-Phosphat-Stoffwechsel
Rpe
Xyl5P
Sed7P
TktI
Ery4P
Tal
Ru5P
Gnd
R5P
GAP
F6P
TktII
6PG
Pgl
GO6P
Zwf
G6P
G6P
F6P
Analoge Darstellung für PPP.
G6P und F6P tauchen je zweimal auf!
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Konkretes Beispiel: Monosaccharid-Stoffwechsel
Benötigter Input:
Deklaration interner und externer Substanzen,
Enzymreaktionen und ihre Richtung
Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)
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Reaktionsschema für Monosaccharid-Stoffwechsel
Kopplung von Glykolyse und
Pentose-Phosphat-Pfad:
15 Metabolite,
19 Reaktionen
Daher besitzt die
stöchiometrische Matrix
die Dimension 15  19.
Welche Reaktionen
müssen notwendigerweise
gemeinsam ablaufen?
Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)
Offensichtlich
{Gap, Pgk, Gpm, Eno, Pyk}
und {Zwf, Pgl, Gnd}.
Weiterhin auch {Fba, TpiA}
und {2 Rpe, TktI, Tal, TktII}.
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Reduktion(I): Reduziertes Schema
Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)
Schema wurde aus vorherigem Schema erhalten indem all Enzyme kombiniert
wurden, die immer gemeinsam operieren.
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Reduktion (II): Elementarmoden
Eine Elementarmode ist ein minimaler Satz von Enzymen, die im Gleichgewicht
operieren können. Minimal heisst: wenn nur die Enzyme einer Mode aktiv sind,
führt Inhibition jedes einzelnen Enzyms zum Stop aller Gleichgewichtsflüsse.
Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)
Identifizierung der Moden:
(1) ursprünglicher Glykolyse-Stoffwechsel. Die Moden (3)-(6) stimmen mit den
4 Moden des Pentose-Phosphat-Stoffwechsels aus Stryer überein.
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Elementarmoden
Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)
Graphische Darstellung von 7 Elementarmoden.
Die Moden beinhalten unterschiedliche Anzahl an Enzymen und überlappen
teilweise miteinander. Die Zahlen entsprechen den relativen Flüssen.
Jeder Systemzustand im Gleichgewicht lässt sich als Linearkombination
dieser Elementarmoden darstellen.
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Software: FluxAnalyzer, setzt auf Matlab auf
Steffen Klamt.
Klamt et al.
Bioinformatics 19, 261 (2003)
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Software: FluxAnalyzer, setzt auf Matlab auf
Links: Network composer of the FluxAnalyzer facilitating
the definition of the network structure.
Mitte: Input mask for defining a new network element of type reaction
Rechts: Pull-down menu of the FluxAnalyzer
http://pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/
providing an interactive use of the various functions of the toolbox.
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Fazit
Stoffwechselpfade sind nicht isoliert voneinander,
besitzen in verschiedenen Organismen verschiedene Komponenten bzw.
Bedeutung.
Oft sind mehrere alternative Reaktionspfade möglich.
Das Program BIOMINER (Prof. Lenhof) wählt z.B. den Pfad/Graphen der
geringsten Länge.
Komplexe metabolische Netzwerke sind daher für uns schwer zu durchschauen.
Man benötigt intelligente und robuste Algorithmen um daraus biologische
Modelle abzuleiten.
Diese biologischen Modelle sehen jedoch vermutlich nicht so einfach aus
wie in heutigen Lehrbüchern.
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E-cell: Software Umgebung zur Simulation ganzer Zellen
Institute for Advanced Biosciences der Keio University (existiert seit 1996)
Dr. Masaru Tomita, Team enthält > 50 Mitglieder!
weitere Programme für integrative Zellsimulationen:
GEPASI (1993, 1997) – Simulation von Stoffwechselpfaden
KINSIM (1983, 1997)
METAMODEL (1991)
SCAMP (1993)
DBSolve (1997)
V-Cell (1999)
es gibt auch separate Programme, mit denen man Genregulation und –expression,
sowie Signaltransduktion und Zellteilung untersuchen kann.
Das allgemeine Problem sind fehlende experimentelle Daten.
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Implementation des E-cell Systems
E-CELL wurde in C++ geschrieben, existiert nun in der Version 3.
Das Modell besteht aus 3 Listen, die bei Programmstart geladen werden:
substance list definiert alle Objekte, die die Zelle und das Kulturmedium enthalten
rule list definiert alle Reaktionen, die in der Zelle stattfinden
system list definiert die räumliche und/oder funktionelle Struktur der Zelle und
ihrer Umgebung
Der Zustand der Zelle zu jedem Zeitpunkt wird als Liste von Konzentrationen und
globalen Parametern wie Zellvolumen, pH und Temperatur angegeben.
Das Programm (simulation engine) erzeugt neue Zustände der Zelle nach
Iterationsschritten von jeweils z.B. t = 1 ms.
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Erstes Modellsystem: Mycoplasma genitalium
1996
Veröffentlichung des Genoms von Mycoplasma genitalium
Dies ist eines der kleinsten bisher bekannten Genome (580 kb).
Es enthält die kleinste bisher bekannte Anzahl von Genen (ca. 480) von allen
bisher bekannten lebenden Organismen.
Genom ist 10  kleiner als E.coli
ca. 80% der Gene sind homolog zu Proteinen mit bekannter Funktion.
Intensive Gene-Knockout Untersuchungen zeigten, dass viele der 480 Gene für
das Überleben von M. genitalium nicht notwendig sind.
Es wurde ein minimaler Satz von 127 Genen als notwendig und hinreichend für
das Überleben und einen stabilen Zustand der Zelle ausgewählt.
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Large-scale Organisation von metabolischen Netzwerken
Modell einer Zelle, die aus eigener Kraft lebt. Diese minimale Zelle besitzt 127
Gene, gerade ausreichend um Proteingehalt und Membranstruktur aufrecht zu
erhalten.
Glukose wird aus der Umgebung als Energiequelle aufgenommen; ATP wird durch
den Glykolyse-Pfad produziert und wird hauptsächlich zur Proteinsynthese
verbraucht.
Proteine und Phospholipide werden mit der Zeit spontan abgebaut.
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127 Gene der überlebensfähigen Zelle
Anzahl der Gene in wichtigen
Pfaden der hypothetischen Zelle.
‚Other‘ sind solche Gene, die in der
Genliste von M. genitalium nicht
gefunden wurden und daher von
anderen Organismen übernommen
wurden, wie z.B. E.coli.
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Für Proteine kodierende Gene in der hypothetischen Zelle
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Enzyme in der hypothetischen Zelle
Die Information über Pfade wurde aus 2
Datenbanken übernommen
KEGG (Kanehisa, 1996):
enthält eine grosse Sammlung von
diagrammatischen Stoffwechselpfaden,
die nicht für bestimmte Spezien spezifisch
sind
EcoCyc (Karp et al. 1996):
Datenbank mit Pfaden mit vielen Links auf
Literaturstellen  sehr nützlich um
kinetische Daten für Reaktionen zu finden.
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KEGG: Stoffwechsel-Datenbank
enthält metabolische Pfade für viele
sequenzierte Organismen
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Substanzen
Kleine Moleküle in der
hypothetischen Zelle:
Metabolite
Aminosäuren
Nukleotide
Kationen
andere Substanzen:
Proteine, DNA, RNA,
Multi-Protein-Komplexe
Protein-DNA Komplexe
Protein-RNA Komplexe
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Reaktionsregeln
495 Reaktionsregeln
(1) enzymatische Reaktionen:
erhöhen und verringern die Mengen von Substraten und Produkten
(2) Komplexbildungen, bei denen mehrere Substrate Komplexe bilden
(3) Transportvorgänge, bei denen Substanzen zwischen verschiedenen
Kompartments ausgetauscht werden (keine Diffusion innerhalb der
Kompartments)
(4) stochastische Prozesse wie die Bindung eines Transkriptionsfaktors
Die Reaktionen (1) – (3) werden als einfache Ratengleichungen formuliert.
Alle Reaktionen werden parallel simuliert.
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Reaktionsregeln
Chemische Reaktionen können verallgemeinert werden als:
v1S1  v2 S2  ...  v j S j  ... vn Sn
Sn ist die Konzentration der n ten Substanz, und n deren stöchiometrischer
Koeffizient. Die Geschwindigkeit jeder Reaktion kann als Funktion von Sn und n
dargestellt werden.
Die meisten nicht-enzymatischen Reaktionen sind erster Ordnung. D.h. ihre
Geschwindigkeiten v hängen direkt von den Konzentrationen der Substrate ab:
j 1
v  k   Si  i
v
i
Enzymatische Reaktionen mit einem Substrat und einem Produkt können durch die
Michaelis-Menten-Gleichung dargestellt werden:
v
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Vmax  S 
S   K m
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41
graphische Kontrolle
Mit Hilfe von verschiedenen
graphischen Oberflächen kann der
Benutzer dynamische Änderungen
der Substanzmengen und
Reaktionsflüsse überwachen.
Die Mengen jeder Substanz können
während der Simulation ausserdem
jederzeit von aussen verändert
werden.
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Ontologische Structur des E-CELL Systems
Es gibt drei fundamentale Klassen: Substanzen, Reaktor und System.
Reaktoren und Zellkomponenten sind die vom Benutzer zu definierenden Klassen.
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43
Transcriptions-Stoffwechsel in der Modellzelle
Komplexe Reaktion wie
Transkription und
Translation werden als
detaillierte Abfolge von
Reaktionen modelliert.
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44
Modell des menschlichen Erythrozyten
Enthält drei grosse Stoffwechselwege: (1) Glykolyse; (2) Pentose-PhosphatStoffwechsel; and (3) Nukleotid-Stoffwechsel.
Abbreviations: ADA; adenosine deaminase;
ADE, adenine; ADPRT, adenine phosphoribosyl transferase;
AK, adenosine kinase; ALD, aldolase;
AMP; adenosine monophosphate;
AMPDA, adenosine monophosphate deaminase;
APK, adenylate kinase; CAH, carbonic anhydrase;
DHAP, dihydroxy acetone phosphate;
DPG, diphosphogrycerate;
DPGase, diphosphogrycerate phosphatase;
DPGM, diphosphogrycerate mutase; EN, enolase;
E4P, erythrose 4-phosphate; FDP, fructose 1,6-diphosphate;
F6P, fructose 6-phosphate; G6P glucose 6-phosphate;
GA3P, glyceraldehyde 3-phosphate;
GAPDH, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase;
GLC, glucose; GLCtr, glucose transport process;
GO6P, gluconate 6-phosphate; GSH, glutathione;
GSHox, glutathione turnover;
GSSGR, glutathione reductase (NADPH);
Hb, hemoglobin; HGPRT, hypoxanthanine-guanine
phosphoryl transferase; HK, hexokinase; HX, hypoxanthine;
HXtr, hypoxanthine transport process;
IMP, inosine monophosphate;
IMPase, inosine monophosphatase;
INO, inosine; LAC, lactate; LACtr, lactate transport process; LDH, lactate dehydrogenase; mOsm, osmolarity; 2PG, 2-phosphogrycerate; 3PG, 3phosphogrycerate; 6PGLase, 6-phosphogluconolactonase; 6PGODH, 6-phosphogluconate dehydrogenase; PEP, phospho-enolpyruvate; PFK,
phosphofructokinase; PGI, phosphoglucoisomerase; PGM, phosphoglyceromutase; Pi, inorganic phosphate; PNPase, purine nucleotide phosphorylase; PRM,
phosphoribomutase; PRPP, 5-phosphoribosyl 1-phosphate; PRPPsyn, phosphoribosyl pyrophosphate synthetase; PYRtr, pyruvate transport process; PYR,
pyruvate; R5P, ribose 5-phosphate; RIP, ribose 1-phosphate; Ru5P, ribulose 5-phosphate; S7P, sedoheptulose 7-phosphate; TA, transaldolase; TK1,
transketolase
I; TPI,
triose WS
phosphate
isomerase; VOL, volume; X5P, xylulose
5-phosphate; X5PI, xylulose 5-phosphate isomerase
10.
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menschlicher Erythrozt mit Aldolase-Mangel
Sowie mit jedem Simulationspaket kann man auch E-CELL benutzen um durch
Änderung von Enzymparametern virtuelle Experimente durchzuführen.
Aldolase wandelt Fruktose-1,6-
bis-phosphat (X12) in
Glyceraldehyd-3-Phosphat (X14)
und Dihydroxy-Aceton-Phosphat
(X13) um.
Durch einen Mangel an Aldolase
steigt der Level des Reaktanden X12
deutlich an und die
Reaktionsprodukte X14 and X13
deutlich abgesenkt.
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Ausblick
Zusätzlich zu der „virtuellen, überlebensfähigen Zelle“ und zum Modell des
menschlichen Erythrozyten werden in Keio andere Modelle konstruiert:
- ein Modell eines Mitochondriums
- ein Signaltransduktionsmodell für Chemotaxis in E.coli
Ein allgemeines Problem von umfangreichen Zellmodellen ist derzeit der
Mangel an quantitativen experimentellen Daten:
- Konzentrationen von Metaboliten und Enzymen
- Flussraten
- kinetische Parameter und Dissoziationskonstanten
Das Institute of Advanced Biosciences in Keio besteht aus 3 Zentren:
Metabolom-Forschung, Bioinformatik, Genom-Engineering.
Ziel: Entwicklung von custom-made Bakterien.
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Zusätzliche Folien (nicht benutzt)
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Beispiel: Stoffwechsel von E. coli
Von den 3399 Reaktionen der
Enzym-Nomenklatur (ENZYME
Datenbank, Bairoch 1999) wurden
in E.coli 604 gefunden.
Dies bedeutet, dass 301 Reaktionen
in E.coli keine E.C. Nummer
besitzen.
 Problem bei auf E.C. Nummern
basierender Bioinformatik ...
Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)
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