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Alexandre L. Martins Valério A. Balani
Introdução
A cinqüenta anos atrás, o estudo da célula se baseava fundamentalmente na observação de suas estruturas com o uso do microscópio. Bem pouco se conhecia do complexo mecanismo que se processa em nível molecular, coordenando, por meio da atividade enzimática, todo o vasto funcionamento íntimo da célula.
Introdução
O DNA foi, há 50 anos atrás, a última grande revolucionária descoberta científica da humanidade, abrindo novos caminhos para o desenvolvimento das ciências da vida e para o nascimento de áreas multidisciplinares de estudo e pesquisa antes desconhecidas. •Biologia Molecular •Bioinformática •Genômica •Proteômica •Engenharia Genética, ...
O que é Bioinformática?
"A bioinformática é uma nova disciplina científica com raízes nas ciências da computação, na estatística e na biologia molecular. A bioinformática desenvolveu se para enfrentar os resultados das iniciativas de seqüenciamento de genes, que produzem uma quantidade cada vez maior de dados sobre proteínas, DNA e RNA. Desse modo, os biólogos moleculares passaram a utilizar métodos estatísticos capazes de analisar grandes quantidades de dados biológicos, a predizer funções dos genes e a demonstrar relações entre genes e proteínas". Universidade de Wageningen, Holanda http://www.bioinformatica.nl
O que é Bioinformática?
Dentre as características da Bioinformática, pode-se citar: O recebimento das seqüências O tratamento de seqüências e a montagem do genoma A anotação do genoma.
Base para novas hipóteses
O que é Bioinformática?
Bioinformática: Um ramo da Biologia Computacional que se vale de “informações” para entender a Biologia. Para tanto, ela constroi ferramentas computacionais com base em “Algoritmos” que representam o comportamento dos dados biológicos, sendo este comportamento definido pela Ciência da Computação como “Estrutura de Dados”.
O que é Bioinformática?
As características funcionais da Bioinformática são: Representação, Armazenamento e Distribuição de dados Biológicos.
O que é Bioinformática?
Qual a importância da BI para os biólogos?
Melhor planejamento experimental, Redução de custos em P&D (homem/hora), Melhor compartilhamento de informações e Melhor Armazenamento de Informações.
O que é Bioinformática?
Importância Genoma Humano: previsto para ser desenvolvido e concluído em 15 anos, foi antecipado, em cerca de 5 anos.
Hoje, um novo gene, com 12 mil bases tem sua seqüência decifrada em 1 minuto, há 3 anos atrás a mesma tarefa levaria 20 minutos.
Breve Introdução aos Conceitos Computacionais da Bioinformática
Dado Menor parte da informação que não possui um significado em si.
Exemplo: 5 6 3 4 5 6.
Estrutura de Dados
Comportamento dos dados e suas características cuja determinação permite definir qual o melhor tipo de tratamento a eles se deve aplicar visando a obtenção de informação sobre estes.
Informação
Conjunto de dados organizado de maneira a possuirem um significado que descreva um objeto.
Ex: 12 anos, 12 anos, 25 anos : a média dos tempos em ano é 16,3 anos.
Algoritmo
Processo de cálculo em que um certo número de regras formais resolvem de forma precisa ou aproximada, na generalidade, sem exceções e de forma finita, problemas da mesma natureza.
Exemplo de Algoritmo
1. Iniciar 2. Armazene X 3. Armazene Y 4. Some X + Y 5. Apresente o resultado 6. Finalizar
Linguagem
Conjunto de regras gramaticais que definem a estrutura de comunicação entre o usuário e o Sistema Computacional.
Um Vírus em C
{ int main() int *i; new(i); } while (i != null) new(i);
Sistema Computacional
Infra estrutura na qual são feitas as implementações dos conceitos computacionais, pode ser dividido em dois conjuntos: Hardware e Software.
Infra-Estrutura específica para a BI
Sistema Operacional(SO)
Software responsável pelo gerenciamento das atividades de um sistema computacional.
UNIX e GNU/LINUX
Estes dois sistemas fazem parte da família X (seu criador não foi o Prof. Xavier) e têm por caracterísiticas: Confiabilidade, Multiplataforma (baixa ou alta), Multiusuário, Multitarefa, Enorme gama de comandos, Não é um sistema amigavel para iniciantes, Possui um conjunto pderoso de aplicativos, POSIX (Portable Operating System Interface), Comunidade de desenvolvedores, Escrito todo em C e Baseado em arquivos texto (.txt)
Por que X?
O motivo da BI usar o Unix/Linux como SO preferêncial está no fato desse SO ter sido criado para desenvovimentos de software de alto desempenho em situações críticas, particularmente aquelas nas quais estão envovidas enormes quantidades de dados. A possibilidade de se usar um SO de alta performance em baixa platamorfa (Linux e FreeBSD) ou se valer dos Clusters que são construidos com base em Linux e fazem as vezes dos Supercomputadores. O fator “preço” também é importante, é possível usar sistemas X sem a necessidade de se pagar direitos autorais. Some a isso o perfil são amplamente usados em outras áreas como física e matemática.
acadêmico destes softwares que já
Linguagem de Programação Perl e BI.
A Linguagem Prática de Extração e Geração de Relatórios - The Practical Extraction and Report Language (ou Pathologically Eclectic Rubbish Lister) uma linguagem de é programação estável e multiplataforma, usada em aplicações de missão crítica em todos os setores, e é bastante usada para desenvolver aplicações web de todos os tipos, foi criada por Larry Wall em dezembro de 1987. A origem do Perl remonta ao shell scripting, Awk e à linguagem C, e está disponível para praticamente todos os sistemas operacionais, mas é usado mais comumente em sistemas Unix e compatíveis. Perl é uma das linguagens preferidas por administradores de sistema e autores de especialmente aplicações para a web. É versátil no processamento de cadeias (strings), manipulação de texto e no pattern matching implementado através de expressões regulares, além de permitir tempos de desenvolvimento curtos. A linguagem Perl já foi portada para mais de 100 diferentes plataformas, e é bastante usada em desenvolvimento web, finanças e bioinformática
Características da Linguagem Perl Perl tira as melhores características de linguagens como C, awk, sed, sh, e BASIC, entre outras.
Sua interface de integração com base de dados (DBI) suporta muitos bancos de dados, incluindo Oracle, Sybase, PostgreSQL, MySQL e outros.
Perl tem módulos para trabalhar com HTML, XML, e outras linguagens de markup. Perl suporta Unicode.Perl permite programação procedural e orientada a objetos. Perl pode acessar bibliotecas externas em C/C++ através de XS ou SWIG. Perl é extensível. Existem milhares de módulos disponíveis no Comprehensive Perl Archive Network (CPAN).
O interpretador Perl pode ser embutido em outros sistemas.
Exemplo de código em Perl
Em Perl
printf “Oi mundo!! \n”; Em C void main() {
printf (“Oi mundo!! \n”);
}
Banco de Dados
Bancos de dados, (ou bases de dados), uma estrutura regular que organizam são conjuntos de dados com informação. Um banco de dados normalmente agrupa informações utilizadas para um mesmo fim.
Um banco de dados é usualmente mantido e acessado por meio de um software conhecido como Sistema Gerenciador de Banco de Dados (SGBD). Normalmente um SGBD adota um modelo de dados, de forma pura, reduzida ou extendida. Muitas vezes o termo banco de dados é usado como sinônimo de SGDB.
O modelo de dados mais adotado hoje em dia onde as estruturas ó o modelo relacional, têm a forma de tabelas, compostas por linhas e colunas.
Bancos de Dados
Sistema de Gerenciamento de Banco de Dados Construção Manipulação Administração
MySQL
•Gratuíto MySQL •Código Aberto PostgreSQL •Acesso Veloz aos Dados Oracle sqlServer
Bancos de Dados
Bancos de Dados
Fonte: GOLD[TM] Genomes OnLine Database http://www.genomesonline.org/
Bancos de Dados
Primários: GenBank EBI-EMBL (European Bioinformatics Institut) DDBJ (DNA Data Bank of Japan) PDB (Protein Data Bank) INSDC – International Nucleotide Sequence Database Colaboration Secundários: PIR (Protein Information Resource) SWISS-PROT
Bancos de Dados
Funcionais: KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Mapas metabólicos de organismos com genoma completamente ou parcialmente seqüenciados Estruturais: Mantém dados sobre estrutura de proteínas Nucleic Acids Research http://www3.oup.co.uk/nar/database/
BD de Seqüências
Há uma quantidade gigantesca de informação sobre biomoléculas em BD públicos Mais de 348 BD – BD de seqüências de nucleotídeos EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl) GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp) UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene) – BD de seqüências de proteínas SWISS-PROT, TrEMBL (http://www.expansy.ch/sprot) PIR (http://pir.georgetown.edu) – BD de motivos Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) PROSITE (http://www.expansy.ch/prosite) – BD de estruturas macromoleculares 3D PDB (http://www.rcsb.org/pdb)
Usos de BD de Seqüências
O que se pode descobrir sobre um gene por meio de uma busca a um BD?
– Informação evolutiva: genes homólogos, freqüências dos alelos, ...
– Informação genômica: localização no cromossomo, introns, ORFs, regiões reguladoras, ...
– Informação estrutural: estruturas da proteína correspondente, tipos de folds, domínios estruturais, ...
– Informação de expressão: expressão específica a um dado tecido, fenótipos, doenças, ...
– Informação funcional: função molecular/enzimática, papel em diferentes rotas, papel em doenças, ...
Busca em BD de Seqüências
O que queremos saber sobre a seqüência?
– Ela é similar ao algum gene conhecido? Quão próximo é o melhor
match
? Significância? – O que sabemos sobre este gene?
Genômica (localização no cromossomo, regiões reguladoras, ...) Estrutural (estrutura conhecida? ...) Funcional (molecular, celular e doença) – Informação evolutiva Este gene é encontrado em outros organismos?
Qual é sua árvore taxonômica?
NCBI e Entrez
A mais usada interface para a recuperação de informação de BD biológicos é o sistema Entrez do NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez )
–
NCBI (National Center for Biotechnology Information)
–
O sistema Entrez tira vantagem do fato que há relacionamentos lógicos pré-existentes entre as entradas indíviduas encontradas em diversos BD públicos Por um exemplo, um artigo no PuBMed sequenciamento de um gene pode descrever o cuja seqüência aparece no GenBank A seqüência de nucleotídeos , por sua vez, pode codificar uma proteína cuja seqüência está armazenada em um o produto de BD de proteínas A estrutura 3D desta proteína pode ser conhecida estrutura podem aparecer em um BD de estruturas - as coordenadas da Finalmente, o gene do cromossomo pode ter sido mapeado BD de mapeamento para uma região específica
–
A existência dessas conexões naturais, levou ao desenvolvimento de um método por meio do qual toda a informação poderia ser encontrada sem ter que visitar sequencialmente BD distintos
Mais que NCBI Links para anotações funcionais fora do NCBI – Gene Ontology - nomes padrões para: Funções moleculares Localização celular Processos – Links para o BD KEGG (vias)
Alinhamento de Seqüências
Possibilitar ao pesquisador determinar se duas seqüências apresentam suficiente similaridade tal que uma inferência sobre homologia possa ser justificada
–
Homologia : significa dizer que duas (ou mais) seqüências tem um ancestral comum História evolutiva
–
Similaridade : é uma medida da qualidade do alinhamento entre duas seqüências, baseada em algum critério Não se refere a nenhum processo histórico Apenas uma comparação das seqüências com algum método É uma afirmação logicamente mais fraca
Relação entre Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Programas mais utilizados: ClustalW Multialin FASTA Blast 2 sequences Blast
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento Global e Local
Alinhamento Global e Local Global – Seqüências são comparadas como um todo Útil quando temos seqüências que diferem pouco entre si Inclui gaps Local – O alinhamento localiza fragmentos de seqüências que são mais similares Algumas vezes não inclui gaps Muitas proteínas não apresentam um padrão global de similaridade – Mosaico de domínios modulares Alinhamento de seqüências de nucleotídeos de um mRNA processado (spliced) com sua seqüencia genômica (Exon/Intron)
Alinhamento de Seqüências
•Unidade pareada (
match
): + •Espaços
(gaps
)
:
•Não pareadas (
mismatch
): -
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Alinhamento de Seqüências
Blast 2
Sequences
Projetos Genoma
•Shotgun •Shotgun hierárquico
Base Calling
Dados Brutos do Seqüênciador Programa de
Base calling
Identifica e atribui valor de qualidade para cada nucleotídeo
Base Calling
PHRED Reconhece arquivos .SCF, .ABI e .MegaBACE ESD Reconhece os dados brutos do seqüenciador Atribui valores de qualidade aos nucleotídeos Gera arquivos de saída com informações sobre o
basecall
e os valores de qualidade (FASTA e PHD)
Base Calling
Cálculo Algorítmo – Métodos de Análise de Fourier.
Qualiadade: probabilidade de erro PHRED Quality -log (
Pe
) Ex: Valor 20 para uma posição nucleotídica significa uma chance em 100 de estar errada Valor 30 para uma posição nucleotídica significa uma chance em 1000 de estar errada
Phred – qualidade dos reads
Alta qualidade Média qualidade Baixa qualidade
Mascaramento de Vetores
Retirada de seqüências contaminantes: Partes de vetores de clonagens DNA adaptores Programa mais utilizado é o Cross_match
Mascaramento de Vetores
Agrupamento de Seqüências
Software de montagem (Assembler) PHRAP CAP3 TIGR Assembler •Leitura do
base call
•Montagem dos
contigs
Agrupamento de Seqüências
Pontos Chaves Uso de seqüências com alta qualidade Uso de informações de qualidade computadas internamente e fornecidas pelo usuário Informações sobre as montagens realizadas Projetos Genoma = Projetos Transcriptoma = contíguo genômico seqüências dos genes expressos
O Phrap
reads Assembler (monta as sequencias contíguas usando as reads).
Contig 1 Região de sobreposição Contig 2
Visualização e Montagem
Progamas Phrapview ou Consed
Standen Package
Standen Package
Standen Package
Standen Package
Standen Package
Fluxo de dados
Sequenciador Indireto Consed Phred Phd2fasta Cross_match Phrap
Análise de Genomas
Então, o que fazer com um genoma completo? Afinal, um genoma seqüenciado consiste apenas de um infinidade de bases em uma ordem definida Análise é obviamente necessária a fim de se obter informações biologicamente interessantes. A análise de um genoma cobre muitos aspectos diferentes
Anotação Gênica
•RepeatMasker •Genscan •tRNAscan-SE •BLAST •InterproGeneOntology •GenomeScan
Definição da localização dos genes (regiões codificadoras, regiões reguladoras) Predição de genes
ab initio
usando software baseado em regras e padrões. Identificação de genes por meio de alinhamento com proteínas conhecidas e seqüências EST Predição de genes por meio de similaridade com proteínas e seqüências EST em outros organismos Predição de genes por meio de comparação com outros genomas Regiões conservadas são provavelmente regiões codificadoras ou reguladoras
Anotação Gênica
Algorítimo gene-finder chamado BGF (BGI GeneFinder) baseado no GenScan e FgeneSH Teste com Drosophila Predição: 13.366 genes Oficial: 13.379 genes