Transcript Aktivitas Peptidyl Transferase dalam Penentuan Afinitas Pengikatan

Aktivitas Peptidyl Transferase dalam
Penentuan Afinitas Pengikatan Antibiotik
(Tiamulin dan Valnemulin)
Mata Kuliah Enzimologi
SYIFA F. SYIHAB
STEVANI O. P.
20509004
20509020
Latar Belakang
Tiamulin
Antibiotik
Pleuromutilin
Valnemulin
Bakteri Resisten
Penurunan Aktivitas Peptidyl
Transferase
Masalah
pengobatan infeksi
Mutasi rRNA dalam ribosom
Mycobacterium smegmatis
Resistensi antibiotik yang
berikatan dengan Peptidyl
transeferase
Peptidyl Transferase
Kelas
Transferase:
transfer satu molekul ke molekul lainnya.
Nama sistematis Peptidyl-tRNA:aminoacyl-tRNA Npeptidyltransferase
Letak
Ribosom
Fungsi
Membentuk ikatan peptide antara asam
amino yang berdekatan dengan
menggunakan tRNAs selama proses translasi
biosintesis protein
Substrat
peptidyl-tRNA1 dan aminoacyl-tRNA2
Produk
tRNA1 dan peptidyl (aminoacyl-tRNA2)
Kofaktor
-
Inhibitor Peptidyl Transferase
1.
2.
3.
Chloramphenicol mengikat residu A2451 dan A2452
pada 23 sRNA dari ribosom dan menghambat
pembentukan ikatan peptida.
Pleuromutillin yang mengikat peptidyl transferase.
Antibiotik macrolide yang menghambat kerja
peptidyl transferase, dan translokasi pada ribosom.
Struktur & Binding Site Peptidyl Transferase
 Binding site peptidyl
transferase pada
erythromycin pada D.
radiodurans.
 Keterangan:
Hijau: antibiotik
Kuning: bagian protein
ribosom L4
Hijau muda: bagian protein
ribosom L22
 Peptidyl transferase
center (PTC): Sisi ribosom
tempat pembentukan
ikatan peptida
Mekanisme Peptidyl Transferase
(P. Nissen et al., Science 289:920–930, 2000)
Ekstraksi Peptidyl Transferase dari Ribosom
(Bruce A. Maguire, et al. 2009. RNA 2008 14: 188-195)
Preparasi Resin
Pembiakan Sel
Preparasi Ribosom
Kromatografi
Analisis PAGE
Ekstraksi & Analisis Protein
Ekstraksi & Analisis RNA
Pengujian Ribosom Binding
Pengujian Translasi &
Transkripsi pada Bakteri
Antibiotik
Senyawa yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme yang
menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain (selektif)
dengan cara menekan atau menghentikan suatu proses biokimia
dalam mikroorganisme (infeksi bakteri).
Antibiotik
Inhibitor
sintesis
dinding sel
bakteri
Penicillin,
Polypeptide,
Cephalosporin
Inhibitor
transkripsi
dan
replikasi
Quinolone
Inhibitor
sintesis
protein
Macrolide,
Aminoglycoside
, Tetracycline
Inhibitor fungsi
membran sel
ionomycin,
valinomycin
Inhibitor fungsi
sel
sulfa atau
sulfonamida
Antimetabolit
azaserine
Tiamulin & Valnemulin
 Merupakan turunan semisintetik dari Pleuromutilin.
 Termasuk antibiotik macrolide yang menghambat
kerja peptidyl transferase & translokasi pada ribosom.
TIAMULIN
Pengobatan disentri,
pneumonia, dan infeksi
mycoplasma pada babi &
unggas
VALNEMULIN
Pencegahan terhadap infeksi enzootic
pneumonia (Mycoplasma
hyopneumoniae) & pathogen
pernafasan (Actinobacillus
pleuropneumoniae & Pasteurella
multocida)
PLEUROMUTILIN
TIAMULIN
VALNEMULIN
PE P T I DY L T R A N S F E R A S E C E N T R E ( P TC ) A DA L A H
S A S A R A N T I A M U L I N DA N VA L N E M U L I N DA L A M
R I B O S O M BA K T E R I .
A: Model letak PTC pada ribosom bakteri 70S.
Kuning (protein), Biru (subunit 30S dan 50S).
Mutasi pada 23sRNA M.smegmatis
• Struktur sekunder
peptidyl transferase dari
23 sRNA pada M.
smegmatis 23S rRNA (E.
coli numbering) .
• Posisi mutasi tunggal
pada strain mutan
ditandai warna hijau
(2055), biru (2447),
merah (2504) dan kuning
(2572).
Valnemulin terikat pada PTC (subunit 50S ribosom E. coli ). Nukleotida mutan:
hijau (2055), biru (2447), merah (2504) dan kuning (2572). Tiamulin (ungu),
nukleotida U2506 & U2585 (turquoise)
Pengujian afinitas pengikatan antibiotik pada
Mycobacterium smegmatis.
Penentuan strain dan plasmid
(pembiakan strain dalam media)
Pembentukan plasmid
(mutasi pada fragmen)
Transformasi dan isolasi mutan
rekombinan
Penentuan laju pertumbuhan strain
(inkubasi 37 ˚C, 3 hari)
Uji kepekaan antibiotik (mengukur nilai OD pada 450
nm yang dibaca oleh microtitre plate reader)
Penelusuran antibiotik (72 jam pada LB
plus antibiotic)
Percobaan pemodelan molekul (Visualisasi struktur
Kristal dan hasil pemotongan oleh VMD)
Strain dan Plasmid yang digunakan
Laju pertumbuhan & kepekaan antibiotik pada 23
sRNA M. smegmatis (strain mutan)
Primer DNA Nukleotida
KESIMPULAN
• Mutasi menunjukkan resistensi valnemulin yang
signifikan.
• Mutasi pada posisi 2447 dan 2504 juga
memberikan resistensi silang terhadap antibiotik
lain yang terikat pada Peptidyl Transferase
dalam M. Smegmatis.
• Pemberian antibiotik pada ribosom mutan
menunjukkan bahwa mutasi menyebabkan
kerusakan struktur pada Peptidyl Transferase
Center dan mengurangi ikatan antibiotik
pleuromutilin.
DAFTAR PUSTAKA
• Beringer, Malte. RNA 2008 14: 795-801
• Bruce A. Maguire, Lillian M. Wondrack, Leonard G. Contillo,
•
•
•
•
•
•
•
et al. 2009. RNA 2008 14: 188-195.
Committee for Veterinary Medicinal Products. 2008.
Tiamulin. European Medicines Agency Veterinary Medicines
and Inspections.
David G S Burch BVetMed MRCVS. Valnemulin - New
Indications for Colitis and Ileitis. Available at: www.octagonservices.co.uk
HF Noller, V Hoffarth, and L Zimniak Science, Vol 256, Issue
5062, 1416-1419. 1992 by American Association for the
Advancement of Science.
Long, S.Katherine, et.al. 2009. Molecular Biology. 71(5),
1218–1227. Blackwell Publishing Ltd.
Mikkelsen, Susan R. and Corton, Eduardo. 2004.
Bioanalytical Chemistry. John Wiley & Sons, Inc., Publication
Nomenclature Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUMB). 2009.
P. Nissen et al., Science 289:920–930, 2000.