Transcript Xylose_Isomerase

Xylose Isomerase
EC 5.3.1.5
Oleh:
Hairunnisa – 20512007
Florence A. Husada – 20512057
Mata Kuliah KI-6161 Enzimologi
November 2012
Agenda Presentasi
Pendahuluan
1
2
Struktur & Mekanisme Reaksi
3
Kinetika Enzim
4
Isolasi & Pemurnian Enzim
5
Aplikasi di Industri
6
Modifikasi Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Xylose Isomerase
EC 5.3.1.5
• EC
EC
EC
EC
5
:
5.3
:
5.3.1 :
5.3.1.5 :
Class Isomerase
Subclass Intramolecular Oxidoreductases
Subsubclass Interconverting Aldoses & Ketoses
Xylose Isomerase
• Katalisis reaksi reversibel dalam isomerisasi
– D-xylosa menjadi D-xylulosa.
– D-glukosa menjadi D-fruktosa (beberapa enzim).
• Memiliki nama lain: D-xylose isomerase; D-xylose
ketoisomerase; D-xylose ketol-isomerase; D-Glucose Isomerase
• Nama sistematik: D-xylose aldose-ketose-isomerase
•http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
•http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sejarah Xylose Isomerase
• Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang
diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa.
1. 1957 – starting point; ditemukannya enzim pada
Pseudomonas hydrophila dengan kemampuan
mengisomerisasi glukosa oleh Marshall & Kooi.
2. Ditemukan aktivitas xylose isomerase pada
Escherichia intermedia . [Diketahui kemudian
sebagai phosphoglucose isomerase (EC 5.3.1.9)].
3. Takasaki & Tanabe mengisolasi glucose isomerase
(GI) (EC 5.3.1.18) dari Bacillus megaterium AI a
yang terikat pada NAD dan spesifik terhadap
glukosa.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sejarah Xylose Isomerase
• Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang
diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa.
4. Aktivitas GI yang sama diisolasi dari
Paracolobacterium aerogenoides yang dapat
mengkatalisis isomerisasi pada glukosa dan
mannosa menjadi fruktosa.
• Dari sekian banyak yang ditemukan, Xylose
Isomerase (EC 5.3.1.5) yang sangat cocok untuk
dikomersialkan.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sejarah Xylose Isomerase
• 1967 – Clinton Corn Processing Co., USA, pertama
kali membuat isomerisasi glukosa enzimatik skala
industri.
• 1980 – Kebutuhan high-fructose corn syrup (HFCS)
dalam industri makanan meningkat, akhirnya
seluruh perusahaan pengolah pati beralih
menggunakan teknologi enzim.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sumber Xylose Isomerase: Prokariot
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sumber Xylose Isomerase: Prokariot
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase
• Spesifisitas Substrat
• Mampu mengubah D-ribose, L-arabinose, L-rhamnose,
D-allose, dan 2-deoxyglucose, seperti substrat yang
biasanya digunakan, yaitu D-glucose dan D-xylose
(afinitas tertinggi).
• Rasio konversi (D-glucose → D-fructose) = 26 – 59%
(dari berbagai organisme).
• Nilai KM untuk D-glucose = 0.086 – 0.920 M
• Nilai KM untuk D-xylose = 0.005 – 0.093 M
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase
• Kofaktor dan Inhibitor
• Kofaktor: Mg2+, Co2+, Mn2+, atau gabungan dari
ketiganya.
• Mg2+ dan Co2+ bertindak sebagai aktivator, Co2+
sebagai penstabil konformasi enzim.
• Inhibitor Logam: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+,dan Ni2+
• Inhibitor Nonlogam: xylitol, arabitol, sorbitol,
mannitol, lyxose, dan Tris.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase
• Suhu dan pH Optimum
• Range suhu optimum = 60 – 80°C (akan meningkat jika
ada ion Co2+).
• Range pH optimum = 7,0 – 9,0.
• Studi Active-Site
• Melalui X-ray crystallography diketahui histidin dan
gugus karboksilat ditemukan pada sisi aktif.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Kelebihan Xylose Isomerase
• Heat-stable
• Tidak membutuhkan kofaktor yang mahal, seperti NAD+
atau ATP.
• Meskipun afinitas enzim untuk glukosa 160x lebih kecil
dibandingkan xylosa, tetapi enzim ini masih sangat
menguntungkan secara komersial dibandingkan dengan
isomerisasi secara kimia.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
Chemical Conversion
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Enzimatic Conversion
• Membutuhkan suhu dan
pH tinggi.
• Dapat bekerja pada pH
dan suhu lingkungan.
• Reaksi tidak spesifik dan
cenderung membentuk
produk samping yang
tidak diinginkan.
• Reaksi spesifik.
• Sulit memperoleh
[fruktosa] > 40%.
• Rasa fruktosa lebih
manis.
• Rasa fruktosa tidak enak
dan kurang manis.
• Tidak menghasilkan
produk samping.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
Struktur Xylose Isomerase
• Berat Molekul bervariasi,
antara 52,000 to 191,000 Da.
• Subunit struktur = trimer,
tetramer, dimer, atau subunit
yang identik (terikat secara
non-kovalen).
6. Modifikasi
Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
Mekanisme Reaksi
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
Kinetika Xylose Isomerase
• Dilakukan pengamatan
terhadap pembentukan Dfruktosa sebagai fungsi waktu
inkubasi dengan konsentrasi
D-glukosa awal.
• Data mengindikasi afinitas Dglukosa terhadap enzim lebih
rendah daripada D-xylosa.
• D-glukosa (KM=0,5 M pada pH
8,0 dan 40°C).
• D-xylosa (KM=3x10-3 M pada
pH 7,5 dan 30°C).
• Suhu optimum ditentukan
pada konsentrasi D-glukosa
0,2 M = 42 – 43°C.
Sumber: Marshall, R. O. and Kooi, R. E., 1957
6. Modifikasi
Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Isolasi Xylose Isomerase dari Streptomyces
Sampel tanah dari ladang jagung dikumpulkan
Diinokulasi pada medium agar berisi salt starch solid dan liquid setelah serial dilution.
Kemudian, dilakukan Gram Staining, uji oxidase, uji hidrolisis pati, gelatin, dan kasein, & uji H2S.
Produksi dan Ekstraksi Enzim
Media produksi yang
digunakan: Xylosa (0,75%),
Peptone (1,00%), Yeast Extract
(0,5%), dan MgSO4.7H2O
(0.1%). pH dijaga agar tetap di
atas 7,0.
Setelah media steril, kultur
diinokulasi, inkubasi 24 jam.
Setelah diproduksi 2,00 mL
pindahkan ke 100 mL lalu
inkubasi lagi. Begitu seterusnya
hingga volume 1000 mL.
Sumber: Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010)
Sel dipanen dan dicuci dengan
akuades, disuspensikan
kemudian dipecah selnya
menggunakan homogenizer.
Debris dipisah agar enzim
dapat dimurnikan.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Pemurnian Xylose Isomerase
• Pemurnian dapat dilakukan menggunakan
metode
– Heat treatment,
– Precipitation menggunakan garam amonium
sulfat-aseton-Mg2+ atau Mn 2+,
– Kromatografi penukar ion,
– Gel filtrasi, dan
– Kromatografi afinitas.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
Aplikasi di Industri
• Produksi Bioetanol
• Interconversion dari xylosa
menjadi xylulosa
menyediakan nutrisi yang
dibutuhkan bakteri
saprofitik untuk melakukan
pembusukan material
tanaman dan biokonversi
hemiselulosa menjadi
bioetanol.
Sumber: http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (11 November 2012 pukul 22.30 WIB)
6. Modifikasi
Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Aplikasi di Industri
• Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS)
• HFCS (glucose:fructose = 1:1) 1.3 kali lebih dari
sukrosa dan 1.7 kali lebih manis dari glukosa.
• Harga HFCS 10 to 20% lebih rendah dari pemanis
sukrosa dan tidak akan mengalami penggumpalan
seperti sukrosa.
• Baik digunakan untuk penderita diabetes karena
direabsobsi secara perlahan oleh perut dan tidak
berpengaruh pada kadar glukosa dalam darah.
• Biasa digunakan pada beverage, baking, canning, dan
confectionery industries.
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
Aplikasi di Industri
• Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS)
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
6. Modifikasi
Genetika
1.
Pendahuluan
2. Struktur &
Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi &
Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di
Industri
6. Modifikasi
Genetika
Modifikasi Genetik untuk Meningkatkan
Produksi Enzim
• Dicapai dengan melakukan strain improvement melalui
mutagenesis atau teknologi DNA rekombinan.
• Hasil dari beberapa modifikasi genetik:
– Peningkatan jumlah enzim sebesar 60% melalui
mutagenesis Streptomyces wedmorensis dengan ethyleneimine
dan N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.
– UV irradiation terhadap Streptomyces olivochromogenes
menghasilkan strain mutan dengan peningkatan aktivitas
70%.
– Mutan yang dimutagenesis dengan ethyl methanesulfonate
menghasilkan1,500 U/mL enzim ketika ditumbuhkan pada
media berisi glukosa saja, sementara parent memproduksi 10
U/mL dengan kondisi yang sama.
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
Daftar Pustaka
•
Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., (1996),
Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase,
Microbiolology and Molecular Biology Review, 60(2):280, p. 280
– 300.
•
Marshall, R. O. and Kooi, R. E., (1957), Enzymatic Conversion of
D-Glucose to D-Fructose, Science, Vol. 125, No. 3249 (Apr. 5,
1957), p. 648 – 649.
•
Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S.,
(2010), Isolation, Purification & Characterization of Glucose
Isomerase Enzyme form Streptomyces species isolated from
Parbhani Region, Journal of Enzyme Research, ISSN: 0976–7657
& E-ISSN: 0976–7665, Vol. 1, Issue 1, p. 01 - 10.
•
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#01
05 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
•
http://www.brendaenzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=5.3.1.5 (diakses pada 11
November 2012 pukul 7.25 WIB)
•
http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&vie
w=INTENZ (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
•
http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (diakses pada 11 November
2012 pukul 22.30 WIB)