Transcript TRANSFORMACIJA BAKTERIJA

TRANSFORMACIJA BAKTERIJA
TRANSFORMACIJA BAKTERIJA
• Postupak ubacivanja plazmidne DNA u
kompetentne bakterijske stanice u svrhu
umnožavanja DNA sekvence od interesa ili
proizvodnje pročišćenih proteina
• KOMPETENTNE STANICE- bakterijske stanice
smrznute u logaritamskoj fazi rasta u puferu koji
sadrži Ca2+ ione
• SELEKCIJA transformiranih klonova bakterijskih
stanica ostvaruje se rezistencijom na određeni
antibiotik sadržan na plazmidu
PLAZMIDNI VEKTORI
• Kružne dvolančane molekule DNA koje se
mogu replicirati neovisno o genomskoj DNA
bakterije
• Sadrže gene za rezistenciju na antibiotike,
bakterijske toksine (bakteriocini), zaštitu od
teških metala, fertilnost
“HEAT SHOCK” TRANSFORMACIJA
TRANSFORMACIJA
ELEKTROPORACIJOM
VRSTE PLAZMIDA
Ovisno o njihovoj funkciji:
• F-plazmidi: osiguravaju bakterijsku fertilnost tj.
mogućnost bakterijske konjugacije
• R-plazmidi: sadrže gene za rezistenciju na antibiotike
(ampicilin, kanamicin, tertraciklin, higromicin)
• Col-plazmidi: nose gene za bakteriocine ( proteine
koji su toksični za druge bakterije)
• Degradativni plazmidi: omogućavaju razgradnju
supstanci poput toluena, salicilne kiseline
• Virulencijski plazmidi: odgovorni za patogenost
bakterija (hemolizin)
VRSTE PLAZMIDA
Ovisno o broju kopija:
NISKO KOPIJSKI (“low-copy”, “stringent”): <100
kopija/stanici; njihovu replikaciju i segregaciju
kontrolira bakterijski kromosom
VISOKO KOPIJSKI (“high-copy”, “relaxed”): > 100
kopija/stanici; manji plazmidi koji se repliciraju
neovisno o bakterijskom kromosomu
VRSTE PLAZMIDA
Ovisno o domaćinu:
• PROKARIOTSKI: umnažaju se i izražavaju u
prokariotskim stanicama
• EUKARIOTSKI: umnažaju se u prokariotima ili
kvascima, a izražavaju u eukariotskim
stanicama (komercijalni plazmidi za genetičko
inženjerstvo)
Razlikuju se u promotorskoj sekvenci
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU
• Jedan od prvih
komercijalnih vektora
• Sadrži nekoliko
restikcijskih mjesta za
kloniranje (BamHI,
EcoRV, ..)
• Gen za rezistenciju za
ampicilin (amp),
tetraciklin (tet) za
insercijsku selekciju
• Ori (origin of
replication) je izvorište
replikacije
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU
• Sadrži višestruko
mjesto za klonirnje
(MCS), ori, gen za
rezistenciju na Amp
• Ugradnja inserta u
MCS unutar lacZ
operona spriječava αkomplementaciju gena
za enzim βgalaktozidazu .
Kolonije s insertom su
bijele boje
PLAVO-BIJELA SELEKCIJA
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU
• Plazmidi za
ekspresiju u
eukariotskim
stanicama
• Sadrže eukariotsku
promotorsku
sekvencu!
• Sadrže dodatnu
TAG sekvencu za
vizualizaciju u
stanicama (GFP,
mCherry, myc, HA,
Flag)
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU
• Plazmidni vektor za
proizvodnju i
pročišćavanje
proteina
• Sustav glutathione-Stransferaze (GST tag)
PROČIŠĆAVANJE GST-PROTEINA
AFINITETNA KROMATOGRAFIJA GSTrekombinantnih proteina
• Metoda razdvajanja i
pročišćavanja proteina
utemeljena na biološkoj
interakciji analita i
liganda
• GST-rekombinantni
protein se veze na
glutation imobiliziran u
koloni za pročišćavanje