Transcript Hartati_20510040_Presentasi_Enzimologi

Presentasi Enzimologi (KI 5162)
(November 2010)
Xylanase (EC 3.2.1.8)
Hartati (20510040)
Institut Teknologi Bandung
Agenda Presentasi
•
•
•
•
Pendahuluan
Isolasi Enzim Xylanase
Pemurnian Enzim Xylanase
Karakterisasi Enzim; pH, Temperatur,
Stabilitas
• Struktur Enzim Xylanase
• Aplikasi dalam bidang industri
Pendahuluan
• Hemiselolusa merupakan komponen terbanyak
kedua setelah selolusa di dalam limbah kayu atau
tanaman
• Hemiselolusa tersusun atas monomer D-xylosa,
D-manosa, D-galaktosa, dan L-arabinosa
• Xylan  polimer organik yang tersusun atas Dxylosa sebagai rantai utama yang berikatan β(1→4) antar residunya.
• Rantai samping terdiri atas L-arabinosa, asetil (O3), glukoronat, 4-O-metilglukoronat, dan pkomarat sebagai gugus samping)
Bastawde, 1992
Pendahuluan (2)
• Dalam dunia industri, banyak menggunakan dan
menghasilkan limbah xylan (industri bleaching
kertas dan pembuatan bioetanol)
• Diperlukan suatu enzim untuk mendegradasi
xylan tersebut  menghasilkan produk dengan
nilai jual lebih
• Solusi  Enzim
Xylanase
Pendahuluan (3)
• Enzim xylanase  mendegradasi xylan menjadi
xylobiosa dan xylooligosakarida rantai pendek
• Xylanase (EC 3.2.1.8)
Nomor Enzim
Hidrolase
Glikosidase
Glikosilase
• Klasifikasi Xylanase
– Endo-β-(1→4)-D-Xylanase
– Exo-β-(1→4)-D-Xylanase
– Β-Xylosidase
Isolasi Enzim Xylanase
• Enzim xylanase dapat ditemukan di organisme
prokariotik hingga eukariotik
• Bakteri laut dan cyanobacteria  sumber
penghasil xylanase
• Pada beberapa penelitian, produksi xylanase
dari mikroorganisme tertentu harus diinduksi
dengan keberadaan xylan.
• Contoh: Bakteri Rayap Pekerja, Reticuletermes
xantonensis, dan Bacillus amyloliquefaciens
• Xylanase dapat diisolasi dari mikroorganisme
termofilik, Bacillus amyloliquefaciens.
• Alasan bakteri termofilik:
– Tahan terhadap temperatur tinggi  aplikasi industri
– Biasanya memiliki pH optimum di atas 7.0 (basa)
• Sumber bakteri berasal dari sampel tanah
(kondisi ekstrem) yang telah disuspensi ke dalam
air steril .
Isolasi Enzim
Screening media padat
(bacto-trypton), 65oC
Screening media padat
(xylan), 65oC
Isolasi koloni tunggal
(kultur media cair)
Pemurnian Enzim
Produksi Enzim
SDS-PAGE
Analisis urutan 16S rRNA
Isoelectric Focusing
Analisis N-terminal
urutan asam amino
Analisis Asam Amino
Analytical
Ultracentrifugation
Circular Dichroism
Ananlisis pH dan T
optimum
Produksi Xylanase (Analisis Pertumbuhan)
• Profil pertumbuhan (▲) dan aktivitas xylanase (■) Bacillus amiloliquefaciens
MIR 32 dalam medium mengandung 10g/L xylan dan 7.7g/L KNO3
Komposisi Asam Amino
• Analisis menggunakan Biotronic 5000 Amino Acid Analyzer yang dilengkapi
dengan kolom kromatografi dengan resin penukar ion
Karakter pH dan Temperatur
• Buffer yang digunakan: Sodium Sitrat (pH 3.0-6.0), Sodium Fosfat (pH 6.0-8.0)
dan Glisin-NaOH (pH 9.0-11.0). Aktivitas 100% = 11.7 U/mL
• Aktivitas 100% untuk variasi temperatur 15.65 U/mL
Kinetika Reaksi Enzimatis
Efek Penambahan Zat terhadap Aktivitas Enzim
• Konsentrasi MnCl2 yang semakin tinggi akan menurunkan
aktivitas enzim  kemungkinan Mn2+ berinteraksi dengan residu
asam amino pada sisi aktif sehingga menyebabkan perubahan
konformasi  enzim tidak aktif
Estimasi Awal Struktur Xylanase (CD)
• Terdapat pita yang tajam pada daerah 198 nm dan adanya pita
melebar pada daerah 220 nm  terdapat campuran antara
bentuk α-heliks dan β-sheet.
• Analisis Self-Consistent  α-heliks, β-sheet, dan β-turn
menunjukkan proporsi yang hampir sama
Analisis Struktur Lanjut
• Xylanase dapat dibagi menjadi dua kelas besar:
Family 10 (F, 35 kDa) dan Family 11 (G, 20 kDa)
• Family 10 (F) mirip dengan β-(1→3) dan β(1→4) glukanase.
• Katalitik domain berbentuk silindris α∕β barrel
dengan sisi katalitik menyempit pada bagian
ujung, dekat karboksil terminal.
• Bentuk struktur family 11  β-pleated diantara
dua layer disekitar sisi katalitik.
• Family 11 (G) memiliki katalitik domain β-pleated sheets
yang membentuk dua layer disekitar sisi katalitik.
• a) 1XNB dari Bacillus circulans, b) 1XND Trichoderma harzanium
Sisi Pengikatan Xylopiranosa
• Pengikatan xylopiranosa terjadi jika terdapat tirosin
yang bersebrangan dengan triptofan.
• Heliks xylan akan diposisikan dan berada diantara
Tyr65 dan Tyr69
• Pada tahap akhir dihasilkan xilobiosa atau xylotetraosa
Bentuk Struktur Pita
• Struktur endoxylanase I dari A. niger
• Daerah β-sheet merupakan daerah pengikatan substrat
dimana terjadi interaksi hidrogen residu xylosa dengan gugus
aromatik
• Residu yang conserved adalah glutamat residu 79 dan 170
Sketsa interaksi sisi aktif A. niger
Aplikasi dalam Bidang Industri
• Digunakan pada industri kertas  sebagai
pemutih kertas (Kraft Pulp Bleaching) dan
menghilangkan kromofor yang menyebabkan
kertas berwarna
• Kraft cooking pada industri kertas mengubah
asam 4-O-metilglukoronat (MeGlcA) menjadi
asam 4-deoxyhex-4-enuronic (HexA)  degradasi
dengan klorin
• MeGlcA dan gugus arabinosa tidak terdegradasi
sehingga tertinggal di dalam senyawa bleaching
• Digunakan enzim xylanase untuk mendengradasi
Kelebihan Enzim Xylanase
• Dalam industri bleaching kertas, menghemat
penggunaan klorin sekitar 20%
• Ramah lingkungan
• Produk kertas yang dihasilkan memiliki kualitas
yang lebih baik.
• Aplikasi enzim xylanase lainnya:
–
–
–
–
–
Industri makanan
Produksi wine
Industri kue dan roti
Degradasi limbah agrikultur
dll
Kesimpulan
• Xylanase mampu mendegradasi xilan dan
menghasilkan gula-gula yang lebih sederhana
(xylobiosa, xilotetraosa, atau xylooligosakarida)
bergantung pada jenis bakteri penghasilnya
• Sisi pengikatan substrat sangat ditentukan oleh
residu tyrosin dan glutamat pada sisi katalitiknya
• Banyak diaplikasikan di dunia industri dengan
karaktersitik berupa termostabil enzim dan
memiliki pH basa
Referensi
• K.B. Bastawde. 1992. Xylan structure, microbial xylanase, and their mode of
action. J. Mol.Biol
• Ute Krengel and Bauke W. Djikstra. 1996. Three-dimensional structure of
Endo-1,4-β-xylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low and
pH optimum. J.Mol.Biol
• Ugur Uzuner, et al. 2010. Enzyme structure dynamics of xylanase I from
Trichoderma longibrachiatum. BMC. Bioinformatics
• Javier D. Breccia, et al. 1998. Purification and characterization of a
thermostable xylanase from Bacillus amyloliquefaciens. Enzym and Microbial
Tech.
• Carlos alberto Martin Cordeiro, et al. 2002. Production and properties of
Xylanase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and
Technology
• Thomas W. Jaffries. 1996. Biochemistry and genetics of microbial xylanases.
Biotechnology
• Bidu Battan, et al. 2007. Enhanced production of cellulase-free thermostable
xylanase by Bacillus pumilus ASH and its potential application in paper
industry. Enzym and Microbial Tech.
Terima Kasih