Transcript 第六章沉淀反应
第六章 沉淀反应 第六章 沉淀反应 第一节 沉淀反应的特点 第二节 液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定 第三节 凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验 第四节 免疫电泳技术 一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳 四、免疫固定电泳 思考题 小结 第一节 沉淀反应原理及特点 沉淀反应（precipitation）是指可溶性 抗原与相应抗体在适当条件下发生特 异性结合而出现的沉淀现象,其特性与 经典的抗原抗体反应相同。 沉淀反应分两个阶段 第一阶段 抗原抗体特异性结合，快 速但不可见。免疫比浊法 中的速率法就是利用此阶 段测定免疫复合物形成的 速率。 第二阶段 形成肉眼可见的大的免疫 复合物。沉淀线或沉淀环 的观察以及免疫比浊法中 的终点法就是测定此阶段 形成的复合物 沉淀反应可分三类 液体内沉 淀试验 免疫 浊度 测定 絮状 沉淀 试验 凝胶内沉 淀试验 单向 扩散 试验 双向 扩散 试验 凝胶免疫 电泳技术 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 第二节 液体内沉淀试验 一、 絮状沉淀试验 •絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型) 絮状沉淀试验 抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例 表6-1 最适比方阵测定法 抗原稀释度 抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照 1/5 + + + + + + + + + + + + ± — 1/10 + + + + + + + + + + + + + — 1/20 + + + + + + + + + + + + + — 1/40 — ± + + + + + + + + + — 1/80 — — — — + + + — 二、免疫浊度测定 原 理 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例 合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定 大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。 利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检 测抗原含量。 免疫浊度测定 影响因素 1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力 强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂 免疫浊度测定 分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法 第三节 凝胶内沉淀试验 原 理 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成 浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适 当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙 烯酰胺凝胶。 一、单向扩散试验 （平板法） 定量试验 原理：抗体与待测的抗原, 在两者比例合适的部位结 合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓度成正 相关。 技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。 单向扩散试验（平板法） 倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环 单向扩散试验 （平板法） 沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法 Mancini曲线： 大分子抗原（IgM） 时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线 Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA） 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线 C为抗原浓度， d为沉淀环直径 Mancini曲线 T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线 Fahey曲线 t1 为16～24h；t2 为24～48h；t3 为48h 以上,可见t1为直线，t3为反抛物线 单向扩散试验 （平板法） 影响因素： • 抗体质量 • 标准曲线 ，质控血清 • 结果与真实含量不符 单克隆抗体；多克隆抗体； 可出现假性降低与增高 • 双环现象 不同扩散率抗原性相同的两 个组分 单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病 理血清 二、双向扩散试验 （平板法） 鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。 技术要点：平板玻璃上倾注一层均 匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔 径为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。 双向扩散试验 （平板法） 应用 1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计 2.抗原或抗体相对分子 量的估计 双向扩散试验 （平板法） 应用 3.抗原性质的分析 双向扩散试验 （平板法） 应用 4.抗体效价的滴定 5.抗原或抗体纯度 的鉴定 第四节 免疫电泳技术 免疫电泳技术 电泳分析 ＋ 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。 沉淀反应 抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量 一、对流免疫电泳 原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍 技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～1h。 对流免疫电泳 通电 － 蛋白质抗原常 带较强的负电 荷，在电场中 向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少， 籍电渗作用向 负极泳动 ＋ 对流免疫电泳 结果分析： • 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。 • 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合。 • 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。 二、火箭免疫电泳 原理 单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的 抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减 少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原 抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄， 形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉 淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗 原量呈正相关。 火箭免疫电泳 技术要点 1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血 清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品， 样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉 淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。 火箭免疫电泳 影响因素 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规 则。 2.电泳终点时间的确定。 3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰 化），抵消了电渗作用。 火箭免疫电泳示意图 + 火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本 三、免疫电泳 原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电 泳分成肉眼不可见的若干区 带 2、沿电泳方向挖一与之平行 的抗体槽，加入相应抗血清 进行双向扩散 。 技术要点：制备琼脂板 打孔，加样于孔内，电 泳2～3mA/cm ，0.5～1h 后，槽内加入相应抗血 清作双向扩散。 免疫电泳 影响因素 抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用 电泳条件直接影响分辨率 应 用 纯化抗原和抗体成分的分析及正常和 异常免疫球蛋白的识别与鉴定 免疫电泳示意图 - + 四、免疫固定电泳 原理 区带电泳＋沉淀反应 免疫电泳原理，不同之处是将抗 血清直接加于电泳后的蛋白质区 带表面，抗原抗体在凝胶中直接 发生沉淀反应，在适当位置形成 抗原抗体复合物，经染色后，可 对各类免疫球蛋白及其轻链进行 分型 免疫固定电泳 技术要点 先将患者血清或血浆在醋纤膜或 琼脂上作区带电泳，根据血清蛋 白质的电荷不同将其分开，然后 将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻 链的抗血清加于分离的蛋白质泳 道，参考泳道则加蛋白质固定剂， 用于区带对照，作用一定时间后 洗去游离蛋白质，染色后则可见 被固定的相应M蛋白成分。 免疫固定电泳示意图 SP G A M κ λ SP G A M κ λ SP G A M κ λ 左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常 免疫固定电泳 应用 最常用于M蛋白的鉴定与分型，也 用于尿中本周氏蛋白质的检测与κ、 λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检 测与分型。 优点 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅 需数小时，结果易于分析。 沉淀反应在医学检验中的应用 1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。 2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快 速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量 标本检测。 3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘 故已不推荐使用。 4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分 析。 5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分 析，常用于M蛋白的鉴定与分型。 思考题 1.什么是沉淀反应？ 2.沉淀反应的特点？ 3.免疫浊度法的原理、方法与分类？ 4.单向扩散试验的原理和应用？ 5.免疫固定电泳的原理及临床应用价值？ 6.何谓Mancini曲线？ 7.何谓Fahey曲线？ 8.影响免疫比浊测定的因素有哪些？ 9.抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？ 10.自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？ 小 结 • 沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发 生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和 检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内 沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。 • 免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平 板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是 电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫 电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。