Transcript La regolazione dell`espressione genica

La regolazione
dell’espressione genica
Anno scolastico 2005/06
Il cromosoma procariote

E’ formato da una catena
continua (circolare) di
DNA a doppio filamento
dello spessore di 2 nm di
diametro; in E.coli
contiene quasi 4,7
milioni di coppie di basi
azotate ed è lungo più di
1 mm se completamente
svolto.
I controllori dei geni



Le cellule controllano l’espressione genica, ossia quali
prodotti genici si ottengono, quando e in quali quantità.
Proteine regolatrici e molecole segnale (come gli
ormoni) appartengono ai sistemi di controllo:
interagiscono tra loro, con il DNA, con l’RNA, con i
prodotti genici
I sistemi di controllo negativi bloccano un’attività
cellulare, quelli positivi la promuovono; i loro effetti
sono reversibili
I sistemi di controllo nei procarioti


Sono a breve termine e riguardano soprattutto la
velocità di trascrizione degli enzimi che agiscono nella
digestione e nelle altre attività correlate alla crescita
Il modello è quello dell’operone studiato da Jacob e
Monod
Francois Jacob, Jacques Monod, Andrè Lwoff
gli scienziati francesi che hanno studiato
la regolazione genica e formulato il modello
dell’operone (Nobel 1965)
Operone batterico
I geni vengono distinti in regolatori e strutturali
 Geni regolatori  codificano per proteine che
“gestiscono” il programma (repressori o
induttori della sintesi di proteine enzimatiche)
 Geni strutturali  codificano per le proteine
enzimatiche.
 OPERONE  gruppo di geni che sintetizzano
enzimi coinvolti in una catena di reazioni
controllati dagli stessi geni regolatori
Il lattosio
Il lattosio è un disaccaride formato da galattosio e
glucosio
Rappresenta per la cellula una fonte di glucosio da cui
ricavare energia
L’utilizzo del lattosio da parte del batterio richiede più
enzimi (βgalattossidasi, permeasi) codificati da geni
strutturali controllati dagli stessi geni regolatori =
operone lac
Operone per il lattosio
GENI
regolatore promotore operatore
Geni strutturali
DNA
RNApolimerasi
trascrizione
RNA
Proteina repressore
attiva
RNA
RNA
RNA
traduzione
repressore inattiva
lattosio
Il gene regolatore sintetizza la proteina repressore; può essere anche lontano dall’operone
Successione eventi: la repressione
1- in assenza del substrato (lattosio) la proteina repressore si lega a un
tratto di DNA (gene operatore) e blocca l’accesso alla RNApolimerasi
al gene promotore dal quale inizia la trascrizione dei geni strutturali
RNA polimerasi non può legarsi:
trascrizione bloccata
Promotore lac
Il repressore viene codificato
da un gene regolatore
repressore attivato
repressore legato
all’operatore
Induttore
(lattosio)
L’induzione
2- In presenza del substrato (induttore), questo si lega alla proteina
repressore e libera l’operatore.
3- RNApolimerasi si lega all’operatore e inizia la trascrizione
RNApolimerasi si lega
al
promotore
Inizia la trascrizione
dei geni strutturali
Induttore (substrato)
legato al repressore
mRNA trascritto
Operone per il triptofano


E’ controllato da un
repressore che è inattivo
quando si trova da solo, per
essere attivo deve
combinarsi con il triptofano,
un aminoacido essenziale
per la sintesi proteica.
Se occorre E.coli può
produrre autonomamente il
triptofano ma, quando è
possibile lo assorbe
direttamente dall’ambiente
Operone con induttori

Gli induttori agiscono rendendo più facile per
l’RNA polimerasi il legame con il promotore,
invece che bloccare l’RNA polimerasi come
fanno i repressori
Sistemi di controllo negli eucarioti



Negli eucarioti esistono
anche sistemi di controllo a
lungo termine e la
regolazione genica è più
complessa.
Il differenziamento cellulare
è la conseguenza di un
espressione selettiva dei geni
nelle diverse cellule
Il controllo si effettua prima,
durante e dopo la trascrizione
L’espressione dei geni può essere regolata a diversi livelli nella via che
porta da DNA a RNA
NUCLEO
CITOPLASMA
mRNA inattivo
5 mRNA degradazione
DNA
RNA transcript
mRNA
1
2
Controllo di
RNA
trascrizione
processing
mRNA
3
4 controllo
RNA
traduzione
trasporto
Proteina
Geni e loro funzioni


Gene regolatore
Gene promotore

Gene operatore


Geni strutturali



Proteina repressore
Sito di avvio della trascrizione del DNA in
mRNA
Sito di inserimento per repressore: blocco
della sintesi dell’ mRNA
enzimi
promotore
RNA polimerasi
operatore
Il cromosoma eucariote
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
Per stare in queste ridotte
dimensione il DNA utilizza
delle strutture proteiche
attorno alla quale si compatta
(istoni e proteine non istoni).
I nucleosomi sono formati da
un ottamero di istoni e su
ognuno di essi si avvolge un
filamento di DNA contenete
200bp.
Essi poi si condensano
ulteriormente in
nucleofilamenti che si
associano in anse su una
struttura polisaccaridica detta
Scaffold.
I livelli di
condensazione della
cromatina: schema
che
illustra le immagini
al microscopio
elettronico
a trasmissione
Il DNA della cellula
interfasica forma delle
anse su proteine
Impalcatura.
Le cellule specializzate conservano
tutto il loro potenziale genetico

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Esperimento di J.B.Gurdon:
asporta i nuclei di cellule
intestinali di girino e li impianta
in cellule uovo di rana private
del proprio nucleo.
Le cellule uovo danno origine a
nuove rane con le caratteristiche
del girino donatore del nucleo
→ i nuclei delle cellule intestinali
contengono tutte le
informazioni necessarie per tutte
le cellule dell’organismo
Condensazione del cromosoma ed
espressione genica
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L’espressione genica è correlata al
grado di condensazione del
cromosoma
La cromatina che durante l’interfase
si despiralizza maggiormente è detta
eucromatina, mentre quella che
rimane più condensata e non viene
trascritta è detta eterocromatina
Uno dei 2 cromosomi X delle
femmine di mammifero rimane
sempre spiralizzato (corpo di Barr)
L’eterocromatina, ossia la cromatina più condensata dei nuclei
interfasici, deriva dalla complessazione con proteine non istoniche.
Ad esempio, a livello dei telomeri si legano alcune proteine che
“silenziano” una regione più ampia di DNA
Gatta calicot
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Nelle sue cellule un cromosoma X porta
l’allele dominante per la melanina, mentre
l’altro specifica la pelliccia gialla
Allo stadio di embrione, uno dei due
cromosomi è stato disattivato in modo
casuale in ciascuna delle cellule presenti in
quel momento.
In tutti i discendenti di quelle cellule è
rimasto disattivato lo stesso cromosoma,
lasciando funzionante un solo allele per il
colore della pelliccia.
Le macchie di colore differente dipendono da
quale allele è stato disattivato
Cromosomi giganti
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Le cellule salivari delle larve di ditteri
mostrano dei cromosomi giganti (per
duplicazioni successive di DNA non
seguite da divisione cellulare)
Questi si presentano a bande scure e
chiare, indice di una diversa
condensazione del DNA e mostrano
dei rigonfiamenti (puff)
la cui posizione varia nel corso dello
sviluppo
I puff corrispondono a regioni di
intensa sintesi di RNA e sono il
segnale visibile dell’attivazione e
disattivazione di specifici geni
durante lo sviluppo
Fattori di trascrizione
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Un gene che codifica per una proteina può possedere un grande assortimento di
sequenze di DNA coinvolte nella regolazione della trascrizione.
Queste sequenze vengono definite elementi di regolazione e possono essere localizzate
sia a monte sia a valle del punto d’inizio della trascrizione dell’RNA.
Questi elementi regolatori possono legare dei fattori trascrizionali specifici,cioè
proteine coinvolte nell’attivazione o nella repressione della trascrizione di un gene.
Gli elementi regolatori in posizione più distale sono chiamati enhancers e sono
necessari per ottenere il massimo grado di trascrizione per un dato gene.
Esistono degli elementi, chiamati silencer, che hanno caratteristiche simili agli
enhancer, ma che reprimono la trascrizione anziché attivarla.
Controllo post-trascrizionale
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I trascritti primari dei geni che specificano gli RNA
sono generalmente delle molecole di RNA precursore o
pre-RNA.
Terminata la trascrizione, per ottenere degli RNA
funzionali, le molecole di pre-RNAdevono essere
modificate.
Possiamo individuare due tipi di modificazioni
principali:


Modificazioni chimiche,nelle quali vengono modificate le basi
(sia negli eucarioti che nei procarioti).
Processamento dell’RNA, per il quale sequenze presenti nel
pre-RNA sono eliminate in modo specifico e preciso (solo
eucarioti).
Aggiunta di cappuccio e coda
all’mRNA
 L’estremità 5’ è modificata dall’aggiunta di un cappuccio in seguito ad un
processo chiamato 5’ CAPPING, questo comporta l’aggiunta di una guanina
(7-metilguanosina) al nucleotide terminale in 5’, mediante un insolito legame
5’-5’, in contrapposizione al consueto legame 5’-3’.Il CAP serve per il corretto
attacco al ribosoma.
 All’estremità 3’ viene aggiunta una sequenza di 50-250 A importante per la
stabilità dell’m-RNA
Splicing
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Generalmente l’introne inizia con
GU al 5’ e finisce con AG al 3’.
Viene effettuato un taglio alla
giunzione in 5’.
L’estremità 5’ libera dell’introne si
piega su se stessa formando un
occhiello e si unisce ad una A, che
fa parte di una sequenza chiamata
sequenza del punto di
Ramificazione.
Taglio al sito di giunzione 3’ di
splicing e ligazione delle due
sequenze codificanti.
Il processamento avviene in
complessi specifici Spliceosoma
costitutite da molecole
ribonucleoproteiche
Alfa-tropomiosina: splicing alternativo specifico per tessuto
Controllo a livello della traduzione
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Tempo di sopravvivenza dell’mRNA:
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Può variare da qualche ora a qualche settimana
maggiore è il tempo di sopravvivenza, più alto è il numero di
proteine prodotte
Presenza di proteine inibitrici che impediscono la
traduzione dell’mRNA in proteina (es. produzione di
emoglobina in assenza del gruppo eme)
Suddivisione del polipeptide in segmenti finali più
piccoli e attivi (es. insulina)
Demolizione selettiva delle proteine
La disponibilità di fattori della traduzione regola l’espressione genica
Il silenziamento genico è stato scoperto da botanici che cercavano di rendere
più intenso il colore dei petali della petunia: introdussero nelle piantine alcune
copie aggiuntive di un gene noto per codificare un enzima chiave nella
colorazione dei petali. Sorprendentemente, molte piantine così trattate non
presentavano gli attesi colori intensi ma erano privi di colore. Senza volere,
disattivando i geni che conferivano colore, avevano scoperto uno dei
meccanismi con cui le cellule cercano di eliminare i genomi virali….
I MECCANISMI DEL SILENZIAMENTO GENICO
Controllo post-trascrizionale
(2 modalità)
(è il caso del colore della petunia)
Piccoli RNA a
interferenza e
micro-RNA
reprimono
la traduzione
di mRNA
bersaglio.
I microRNA
inibiscono in
maniera reversibile
la traduzione;
gli RNA a
interferenza
causano la
degradazione
dell’mRNA
complementare.
Questo meccanismo
si è evoluto come
difesa nei confronti
dei virus.
RNA interferenza

RNA interferenza è un meccanismo di “silenziamento
post-trascrizionale”: un RNA a doppio-filamento
(dsRNA) blocca, in modo specifico, l’espressione di
geni omologhi attraverso l’appaiamento con l’mRNA
bersaglio e la degradazione dello stesso. Questo
processo rappresenta in piante e animali un sistema di
difesa naturale contro infezioni causate da virus a RNA,
nonché un possibile meccanismo di regolazione dei
geni durante la crescita e lo sviluppo.
Il sistema iRNA
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La sua scoperta ha permesso ai ricercatori Andrew Fire, docente di patologia e genetica
presso la Stanford University, e Craig Mello, ordinario di medicina molecolare alla
University of Massachussets, di aggiudicarsi il premio Nobel 2006 per la medicina.
Quasi tutte le cellule vegetali e animali hanno meccanismi interni che utilizzano forme
insolite di RNA per silenziare in modo naturale i geni a uno a uno mediante l'RNAi.
L’importanza di questa scoperta consiste anche nella possibilità mettere a punto di
nuovi protocolli terapeutici, basati appunto sul silenziamento di geni collegati a
malattie.
Dagli esperimenti condotti sui vermi nematodi, Fire e Mello hanno scoperto che il
meccanismo noto come RNAi viene attivato quando nella cellula sono presenti
molecole di RNA a doppio filamento. L'RNA a doppio filamento innesca un processo
che degrada le molecole di mRNA che contengono una sequenza complementare a
quella dell'RNA a doppio filamento.
Quando queste molecole di mRNA scompaiono, il gene corrispondente viene
silenziato e non viene prodotta alcuna proteina del tipo codificato.
Quando un gene estraneo, virus o trasposone compare nella cellula, questa,
riconoscendolo come estraneo, attraverso un meccanismo che ancora non è stato
compreso, lo induce a convertire il suo mRNA in RNA a doppio filamento, inducendo
di conseguenza la risposta di inibizione.
Meccanismo

L’RNA a doppio filamento incontra un enzima
chiamato "Dicer", il quale taglia il lungo RNA in
pezzi di circa 21-23 nucleotidi, gli siRNA. L’enzima
taglia entrambi i filamenti in maniera leggermente
sfalsata, così da lasciare due nucleotidi che
sporgono ad ogni estremità. Successivamente i due
filamenti dell’siRNA si separano e uno dei due
entra a far parte di un complesso proteico,
chiamato RISC, ossia Complesso di silenziamento
indotto dall’RNA (RNA-Induced Silencing
Complex).
Un’opportuna disposizione dell’siRNA all’interno
del complesso fa in modo che gli mRNA presenti
in ogni momento nella cellula possano urtare
contro di esso. Ma solo l’RNA messaggero
perfettamente o quasi perfettamente
complementare ad esso potrà aderire alla sua
sequenza nucleotidica.
Quando ciò si verifica un enzima chiamato "Slicer"
taglia in due il filamento di mRNA, rendendolo
inattivo e procede oltre, libero di catturare un altro
mRNA. In tal modo il sistema iRNA utilizza i
frammenti di mRNA a doppio filamento per
identificare e inattivare gli RNA messaggeri
corrispondenti.
RNA come silenziatore: i microRNA
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Sono stringhe di acido nucleico lunghe 19-22 basi non codificanti proteine
Sono direttamente coinvolti nella genesi di molti tumori
Queste molecole hanno la capacità di inibire la traduzione dell’mRNA in
proteine. Sono regolatori endogeni dell’espressione genica che si attivano
quando un’enzima li stacca da una molecola di RNA più lunga, tagliandola in
punti strategici
Una volta liberati individuano il loro bersaglio: l’mRNA che sta per essere
tradotto in proteina
Se non c’è perfetta complementarietà di basi con il bersaglio ne bloccano la
traduzione legandosi ad esso. Se la complementarietà è totale ne causano la
degradazione
Il bersaglio possono essere mRNA che derivano da oncogeni o
oncosopressori. Nel primo caso la perdita di microRNA attiva geni che
sarebbe meglio restassero silenti. Nel secondo caso vengono silenziati geni
protettivi che impediscono lo sviluppo tumorale.
Regolazione dell’espressione genica
durante lo sviluppo

I meccanismi di
regolazione
dell’espressione genica
durante lo sviluppo non
sono del tutto noti, ma si
può delineare un modello
valido in linea generale
Geni omeotici
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
Sono gruppi di geni pressocchè
identici che controllano l’abbozzo
generale dell’organismo in specie
animali anche molto diverse
Hanno in comune una sequenza
simile di circa 180 nucleotidi detta
homeobox

Sono attivati durante lo sviluppo
sempre nello stesso ordine che
corrisponde all’ordine con cui essi
sono disposti nel cromosoma,
ossia dall’estremità posteriore a
quella anteriore del corpo
Sequenza di trasduzione del segnale
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Serie di cambiamenti che
trasformano un segnale chimico che
arriva su una cellula in una risposta
specifica della cellula bersaglio
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La cellula che trasmette il messaggio
secerne una molecola segnale
La molecola si lega a un recettore sulla
membrana della cellula bersaglio
Il legame attiva delle proteine
amplificatrici
Viene attivato un fattore di trascrizione
che attiva la trascrizione di uno
specifico gene