Transcript Crioconservazione di gameti ed embrioni

Crioconservazione
di gameti ed embrioni
Rosanna Ciriminna
Centro Ambra- Palermo
Adina Massacesi
Centro Bios -Roma
La criobiologia ha molto a che fare con l’acqua:
si può ricondurre infatti alla maniera di congelare
l’acqua intracellulare senza uccidere le cellule.
La crioconservazione è una branca della
criobiologia che consente il mantenimento
della vitalità cellulare per un tempo
prolungato, tramite congelamento a
temperatura di –196°C in azoto liquido.
Il principio fondamentale della
crioconservazione è quello di interrompere
i processi biochimici del metabolismo
cellulare.
Ciò si ottiene convertendo in ghiaccio
(CONGELAMENTO), a temperature
sufficientemente basse, l’acqua presente
all’interno delle cellule.
La crioconservazione è valida se il sistema
biologico torna a temperatura normale
(SCONGELAMENTO) senza dover
sopportare insulti strutturali o biochimici
che possano causarne la morte cellulare.
È POSSIBILE CRIOCONSERVARE







Spermatozoi
Tessuto testicolare
Ovociti
Tessuto ovarico
Zigoti
Preembrioni prima della compattazione
Blastocisti
SPERMATOZOI
E
TESSUTO TESTICOLARE
BANCA DEL SEME
Autoconservazione degli spermatozoi
Preservare la potenzialità riproduttiva
•Soggetti
•Soggetti
•Soggetti
•Soggetti
ipofertili
con azoospermia
che si sottopongono a vasectomia
che devono sottoporsi a chemio e/o radioterapia
La crioconservazione è
fondamentale nei casi in cui si
assiste ad progressivo
abbattimento dei valori di
concentrazione, motilità e
morfologia nemaspermica.
La possibilità di crioconservare il
liquido seminale è di notevole
vantaggio per la gestione dei
protocolli terapeutici finalizzati
alla procreazione assistita
La crioconservazione risulta essere
una procedura prioritaria ed
imprescindibile
nei casi di AZOOSPERMIA
quindi per
SPERMATOZOI TESTICOLARI
Qualunque sia la tecnica
di prelievo a livello testicolare
MESA
TESA
TESE
PESA
TFNA
Si procede alla
CRIOCONSERVAZIONE
ICSI
Vantaggi della crioconservazione di
spermatozoi testicolari
Possibilità di raccogliere e studiare campioni
testicolari di pazienti gravemente
oligoastenospermici o azoospermici in fase
diagnostica, quindi prima che la partner
venga sottoposta a stimolazione della
crescita follicolare multipla per l’ esecuzione
della fecondazione in vitro mediante ICSI.
La crioconservazione non modifica i
risultati di fertilizzazione,
formazione di embrioni e possibilità di
gravidanza se la motilità degli
spermatozoi è anche
parzialmente conservata
OVOCITI
ED
EMBRIONI
Ci sono così poche pubblicazioni sulla
crioconservazione di ovociti


La tecnica è considerata poco efficiente
In alcuni paesi ci sono restrizioni legali (Francia)
Le uniche indicazioni valide sono:
• rifiuto della crioconservazione di embrioni
• conservazione della fertilità
• divieto di congelare zigoti o embrioni.
2004
Legge 40
Art. 14 – Limite all’applicazione delle tecniche.
E’ vietata la crioconservazione degli embrioni.
“Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per
grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute
della donna non prevedibile al momento della fecondazione e' consentita
la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento,
da realizzare non appena possibile.”
TECNICHE DI
CRIOCONSERVAZIONE
Sloow cooling – congelamento lento
Vitrificazione – congelamento rapido
OVOCITI IN Metafase II: risultati




Polak de Fried et al, FS 1998

2 ovociti fecondati : nascita di un maschio sano
Antinori et al, ESHRE 1998

38 transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing
Young et al, FS 1998

9 ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni
trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws)
Trounson et al, ESHRE 2000

3 bambini nati
Molto incoraggianti ma solo l’ 1% di nati
MODIFICHE AL PROTOCOLLO
portano al miglioramento dei risultati in
termini di sopravvivenza ovocitaria
Porcu et al., 2000
Fabbri et al., 2001
Fosas et al., 2003
Chen et al., Borini et al. 2005
sopravvivenza 54%
sopravvivenza 82%
sopravvivenza 89%
sopravvivenza 75-80%
Ancora non soddisfacente il numero di bambini nati
Crioconservazione di ovociti
Efficienza
La crioconservazione degli ovociti è stata considerata una tecnica
a bassa efficienza a causa della bassa sopravvivenza,
fertilizzazione e capacità di divisione dell’embrione.
Il miglioramento dei protocolli di congelamento ha reso la tecnica
più soddisfacente in termini di sopravvivenza degli ovociti allo
scongelamento,
Con l’ introduzione dell’ ICSI sono migliorati i risultati anche in
termini di fecondazione, di formazione degli embrioni e di
impianto.
La sopravvivenza allo scongelamento è l’unico
criterio per valutare la qualità degli ovociti
crioconservati



La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo
non sono necessariamente correlate con criteri
clinici o morfologici.
L’assenza di degenerazione dopo scongelamento
non è un indicatore attendibile della vitalità.
La sopravvivenza deve coincidere con la
conservazione dei fattori morfofunzionali
essenziali verificabili oggettivamente.
VITRIFICAZIONE
Si basa sul concetto fisico della
solidificazione senza formazione di
cristalli di ghiaccio così come avviene
nel congelamento lento.
pubblicazioni: VITRIFICAZIONE
140
120
100
80
60
40
20
0
1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006
L’interesse verso questa tecnica ha avuto un grosso incremento negli ultimi anni
Kuleshova et al., nel 1999
riportarono la prima nascita dopo
vitrificazione e scongelamento di
17 ovociti
CONFRONTO TRA SLOW FREEZING E
VITRIFICAZIONE
AUTORE
Fabbri, 2001
Chen, 2005
Boldt, 2006
Yoon, 2003
Kuwayama,
2005
Cobo, 2007
Yoon, 2007
METODO
% SOPRAV
% FERT
N° OVO/GRAV
SF
53
79
94
SF
SF
75
60
67
61
23
26
VF
VF
68.6
91
71.7
90
79
5
VF
VF
97
85.1
76.3
77.4
11
21
Risultati della vitrificazione di ovociti
AUTORE
N° CASI
N° OVO
SCONG
SR %
N° CG
NATI
Kuleshova, 1999
4
17
65
1
1
Wu, 2001
36
79
59
1
0
Yoon, 2003
34
474
69
8
7
Kim, 2003
16
51
80
1
0
Chian, 2005
15
180
94
11
0
Kuwayama, 2005
67
107
80
12
7
Katayama, 2003
6
46
94
2
2
Kyono, 2005
1
5
100
1
1
Lucena, 2006
23
159
75
13
0
Selman, 2006
6
24
75
3
0
Yoon, 2007
28
364
85
17
0
Antinori, 2007
120
330
99
39
3
I migliori risultati pubblicati nel 2007 riportano:
- sopravvivenza ovocitaria 85%
- gravidanze
43,5 %
E’ IN CORSO UNO STUDIO MULTICENTRICO SULLA VITRIFICAZIONE
DI OVOCITI
proposto dalla
Scopo
Verificare l’efficacia della vitrificazione di ovociti.
Lo studio è stato approvato dal comitato di bioetica
dell’Università di Pisa è stato avviato a settembre
2007 e sono già stati vitrificati circa 150 ovociti.
OVOCITI O EMBRIONI?
PRO
Ovociti



Superamento problemi
etico-legali
Preservazione della fertilità
in pazienti oncologiche o
con problemi diversi.
Recupero degli ovociti
quando il seme non è
disponibile
Embrioni



Riproducibilità dei risultati
Omogeneità degli standard
operativi
Verifica sui nati
OVOCITI O EMBRIONI?
CONTRO
Ovociti



Problemi biologici
Inevitabilità della ICSI
Tecnica sperimentale
Embrioni


Problemi etici e legali
Embrioni“abbandonati”
ZIGOTI



ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA
CRIOCONSERVAZIONE
VERIFICA DELLA VITALITA’
POTENZIALITA’ DI IMPIANTO SIMILE AGLI
EMBRIONI FRESCHI
EMBRIONI



BUONA SOPRAVVIVENZA SE LA MORFOLOGIA E’
OTTIMALE
LIMITATA POSSIBILITA’ DI OSSERVARE LA
RIPRESA DELLE DIVISIONI DEI BLASTOMERI
POTENZIALITA’ DI IMPIANTO INFERIORE AGLI
EMBRIONI FRESCHI
BLASTOCISTI
cavità
Inner cell mass





SELEZIONE DEGLI EMBRIONI PIU’ VITALI
MINOR NUMERO DI CONGELAMENTI
MAGGIORE NUMERO DI CELLULE
MINORI DIMENSIONI DELLE CELLULE
LE BLASTOCISTI OTTENUTE IN VITRO CON I
TERRENI SEQUENZIALI RESISTONO MALE
ALLA CRIOCONSERVAZIONE.
trofoblasto
In conclusione


Rimangono ancora molti aspetti della criobiologia,
soprattutto degli ovociti, che devono essere
chiariti in modo da ottimizzare le tecniche.
La crioconservazione di ovociti non può
prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la
maturazione in vitro.
In conclusione
La cosa più importante è comunque porre la
massima attenzione a che tutte le tappe dei
procedimenti di congelamento e scongelamento
siano effettuati con precisione e soprattutto alle
giuste temperature.