Transcript Клонирование

ОСНОВЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
БИОЛОГИИ
Лекция 3
Клонирование: проблемы и
перспективы
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. М.: Мир, 1994.
235 с. ГЛАВА 8
http://www.fidel-kastro.ru/biology/DevBioV2.htm
Чайлахян Л. М, Вепринцев Б. Н., Свиридова Т. А., Никитин В. А.
Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии
http://www.pereplet.ru/nauka/anobele/klon/bio.html
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ЧТО ТАКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ?
КЛОНИРОВАНИЕ
(от древнегреч. κλών — «веточка, побег, отпрыск»)
получение генетически идентичных живых
организмов из соматических клеток
ВИДЫ КЛОНИРОВАНИЯ
ЕСТЕСТВЕННОЕ
• Агамогенез: форма
размножения, при которой
организм воспроизводит себя
самостоятельно, без участия
другой особи (одноклеточные,
грибы, водоросли, растения,
животные)
• Партеногенез: амейотическая
форма (дафнии)
ИСКУССТВЕННОЕ
• Индуцированный
партеногенез: получения
потомства в контролируемых
условиях (тутовый шелкопряд,
растения)
• Микроклонирование растений
• Транснуклеогенез: перенос ядер
соматических клеток с целью
терапевтического и/или
репродуктивного клонирования
(животные)
Тотипотентность: способность клетки
проходить через все стадии развития и
таким образом давать взрослый организм
МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ИСТОРИЯ МЕТОДА КЛОНИРОВАНИЯ
ЖИВОТНЫХ
РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕОРИИ
Маттиас Якоб Шлейден, Теодор Шванн, Рудольф Вирхов
ЭКСПЕРИМЕНТ В. РУ
(мозаичной развитие)
1885 г.
нескольких дней культивировал нервную пластинку куриного
эмбриона
1888 г.
попытался с помощью обычной иголки, раскаленной на огне,
разделить эмбрион лягушки, состоящий из двух клеток.
Wilhelm Roux
(1850-1924)
ЭКСПЕРИМЕНТ Х. ДРИША
(регуляционное развитие)
1892 г.
обнаружил, что при разделении первых двух бластомеров у амфибий
и иглокожих каждый из них даёт полноценного зародыша, а затем и
личинку, из которой может развиться нормальный взрослый организм
Ханс Дриш
(1867-1941)
ЭКСПЕРИМЕНТЫ Х. ШПЕМАНА
1901 г.
провел эксперимент с эмбрионом амфибии: разделил
его на отдельные клетки и из каждой впоследствии
вырастил вполне нормальных головастиков.
Ханс Шпеман
(1869-1941)
ЭКСПЕРИМЕНТЫ Х. ШПЕМАНА и Г. МАНГОЛЬД
1921 г.
открыли явление эмбриональной
индукции – взаимодействие
элементов развивающегося
зародыша, при котором воздействие
одного из них направляет
(индуцирует) развитие другого
а - схема опыта; б - поперечный срез на
стадии закладки двух комплексов осевых
органов.
1 - спинная губа бластопора; 2 - презумптивная
мезодерма; 3 - презумптивная хорда;
4 - материал донора; 5 - инвагинация;
6 - бластоцель; 7 - первичная инвагинация;
8 - вторичная инвагинация; 9 - хорда;
10 - нервная трубка; 11 - мезодерма;
12 - полость кишки; 13 - энтодерма
ЭКСПЕРИМЕНТ Г.В. ЛОПАШЕВА
1948 г.
разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку
лягушки
Георгий Викторович
Лопашов (1912-2010)
ЭКСПЕРИМЕНТ Р. БРИГГСА и Т. КИНГА
Роберт Бриггс и Томас Кинг
(1911-1983)
(1921-2000)
1952 г.
повторили и усовершенствовали
метод трансплантации ядер
ЭКСПЕРИМЕНТ Дж. ГЕРДОНА
Джон Гёрдон
(1933)
1962 г.
использовал в качестве донора ядер
специализировавшиеся клетки эпителия
кишечника головастика. Выживало не
более двух процентов клонированного
потомства.
1970-е гг.
разработал метод серийных пересадок
ЭКСПЕРИМЕНТ К. ИЛЛМЕНСЕЕ и П. ХОППЕ
Карл Иллменсее
(1939)
1982 г.
получили серых мышат, перенеся ядра
клеток серого зародыша в цитоплазму
яйцеклетки, полученной от черной
самки, после чего эмбрионы были
перенесены в белых самок, которые и
выносили потомство.
Результаты не были воспроизведены в
других лабораториях, Иллменсее
обвиненили в фальсификации.
Питер Хоппе
(1938-2010)
ЭКСПЕРИМЕНТ Л.М. ЧАЙЛАХЯНА и сотруд.
1987 г.
первое клонирование млекопитающих
(лабораторная линия мышей-альбиносов
CBWA )
Чайлахян Л.М, Вепренцев Б.Н., Свиридова
Т.А., Никитин В.А. Электростимулируемое
слияние клеток в клеточной инженерии
//Биофизика, 1987
Мышку клонировали из невзрачной тушки,
которая 16 лет провела в холодильнике
ЭКСПЕРИМЕНТ Я. УИЛМУТА
Кейт Кэмпбэлл
(1954-2012)
Ян Уилмут Долли
(1944)
(1996-2003)
Билл Ритчи
Карен Майкок
ЭКСПЕРИМЕНТ Р. ЯНАГИМАЧИ и сотруд.
усовершенствование метода переноса ядра:
изобрели микропипетку, с помощью которой
можно было безболезненно извлекать ядро из
соматической клетки и трансплантировать его
в энуклеированную яйцеклетку.
Риузо Янагимачи
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
КЛОНИРОВАНИЯ
ПРОБЛЕМЫ
ПРОБЛЕМА ПЕРЕСАДКИ ЯДЕР
ПРОБЛЕМА РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ЯДРА И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ
ГЕНОМА
ПРОБЛЕМА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕПРОДУКТИВНОГО КЛОНИРОВАНИЯ
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
МЕТОДЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЯДЕР
ОСНОВНЫЕ МЕОТДЫ
МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ (использование микропипеток)
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (использование химических веществ,
например цитохалазина В)
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (электростимуляция)
МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ
1. тонкой микропипеткой прокалывают
зоны пеллюцида и плазматической
мембраны и извлекают пронуклеусы
2. пипеткой, большего диаметра (12
мкм) в то же отверстие вводят
диплоидное ядро донора.
В этом случае меньше травмируется
цитоплазма зиготы и транспортируемое
ядро донора
ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ
1. первый разряд – для слияния клеток
2. второй – для стимуляции механизма
дробления
ХИМИЧЕСКОЕ СЛИЯНИЕ
получение цитопластов
и кариопластов
центрифугирование
цитохалазин В
Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности.
Кариопластов выделяют через ряд операции по
центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д.
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ПОСЛЕДСТВИЯ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ
ЯДРА И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ
ГЕНОМА
РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНОТИПА В ФЕНОТИП
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ
наследование особенностей экспрессии генов
ПРИМЕРЫ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯВЛЕНИЙ
Метилирование ДНК в области промотора
гена: наследование окраски мышей
Случайная инактивация одной из
Х-хромосом
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
• Посттранскрипционная
модификация гистонов
• АТФ-зависимый
ремоделлинг хроматина
• mРНК
ПОСЛЕДСТВИЯ
НАРУШЕНИЕ ПРОЦЕССА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК
ДИСРЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ
НАРУШЕНИЕ «ГИСТОНОВОГО КОДА»
КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК
ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ
МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ
Зеленый – метилирование лизина и аргинина
Желтый – фосфорилирование серина и треонина
Красный – ацетилирование лизина
Синий – убиквитинирирование лизина
КАК РАБОТАЕТ ГИСТОНОВЫЙ КОД
КАК РАБОТАЕТ ГИСТОНОВЫЙ КОД
ИЗМЕНЕНИЕ СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ
В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
mРНК
СИНДРОМ РЕТТА
доминантное сцепленное с Х-хромосомой
постнатальное нарушение развития и
нервной системы
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ФОРМЫ КЛОНИРОВАНИЯ
ФОРМЫ
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
МОЛЕКУЛЯРНОЕ
КЛОНИРОВАНИЕ
получение клонов генов на
основе техники
рекомбинантных ДНК
РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
создание точной копии организма с
использованием его генетического материала
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
получения клеточных культур –
трансплантатов
1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота)
2. Зигота делится надвое
3-4. Митотическое деление
продолжается
5. Через 5-6 дней образуется
бластоциста
6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ)
помещают на питательную среду для
получения стволовых клеток
ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ.
КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ
ПЕРСПЕКТИВЫ
ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ
терапевтического клонирования
КЛЕТОЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ
КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ
ПЕРСПЕКТИВЫ
ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ
репродуктивного клонирования
КОНИРОВАНИЕ ИСЧЕЗАЮЩИХ И ВЫМЕРШИХ ВИДОВ
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПЕРВИЧНОГО БЕСПЛОДИЯ
КОММЕРЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ