Universidad Nacional de La Matanza Ciencias de la Salud - MEDICINA

AU1 - Formación del Ser Humano Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética

DESORDENES MONOGÉNICOS

Aparecen cuando un gen está alterado en todas las células del organismo Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios en las secuencias de los nucleótidos de la cadena de ADN HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA HERENCIA LIGADA AL X HERENCIA MITOCONDRIAL

Patrones de herencia de una enfermedad monogenica

ENFERMEDADES DE ORIGEN POLIGÉNICO

Originadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y de factores ambientales que las favorecen La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de tablas estadísticas específicas de cada desorden.

Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología Molecular

Diabetes juvenil Alzheimer Enfermedad celíaca Enfermedad cardiovascular Parkinson

AMPLIFICACION DEL ADN

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

-ADN total -Taq polimerasa -Mg -Buffer -Primers Ciclos: Desnaturalización Hibridación Elongación

10 rep 20 rep

Pocas copias de un fragmento Millones de copias PCR 20 rep 10 rep

Forward primer

3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Separación de las cadenas Desnaturalización

DNA diana

5’ Pegador de los primers (annealing) Hacer copias (extensión) 5’ 3’ 3’ 5’

Reverse primer

Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el número de ciclos

En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de

copias (2 n = 2 32

copias)

Ejemplos de diagnósticos que se hacen por PCR (monogénicas) Distonía de torsión temprana (autosómica dominante)

- Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva)

Enfermedad de Duchenne (ligada al X)

Distonía primaria (DYT1)

Deleción de tres pares de bases (GAG) en el gen DYT1 Frecuencia 72% de los pacientes con distonía primaria de comienzo temprano Herencia autosómica dominante Técnica PCR y corrida electroforética en geles de poliacrilamida Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.

Distonía primaria (PTD)

Ctrol N/M Padre Madre Hijo Hija 250 pb 247 pb Se han descripto numerosos casos de aparición

de novo

de esta deleción

Microsatélites

Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos un número n de veces

dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n-- ---CGCGCGCG(CG)n trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n-- ---CCTCCTCCT(CCT)n-- tetranucleótidos: --(CATG)n- ó --(CCGG)n- Características: -Hay alelos con distinto número de repeticiones -Se heredan mendelianamente -Muchas enfermedades neurológicas se originan por un incremento anormal del número de repeticiones

Southern Blot

• • • • • Extracción de una gran cantidad de ADN genómico total Digestión con enzimas de restricción Corrida electroforética Transferencia a una membrana de nylon Identificación de una zona específica del ADN con sondas marcadas • Se usa en diagnósticos de enfermedades como la Distrofia Miotónica.

FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern Blot

Corte mediante enzimas de Restricción.

SOUTHERN BLOT

Distrofia Miotónica (DM)

Secuenciación del ADN

• • •

Manual o automática PCR con nucleótidos especiales Permite conocer la secuencia exacta de pares de bases en un fragmento de ADN

Tecnología de Microarrays

• Está basada en la idea de Southern de que moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas para analizar otras moléculas de ADN unidas a un soporte sólido • El “Southern blot” fue el primer array • Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a librerías de ADNc sobre membranas de nylon • Dot-blot con sondas ASO

Paneles de riesgo para enfermedades complejas: -Enfermedad arterial coronaria -Infarto de miocardio Fibrilación auricular Cuadro trombótico Enfermedad arterial periférica

Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel Ashkenazi): Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística, Mucolipidosis, etc.

Al leer el informe de un estudio genético:

• • • • •

¿Qué mutación/es se estudió/aron?

Si no se encontró ninguna mutación, ¿se puede descartar la enfermedad?

¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la técnica adecuada para el/la paciente?

¿Cuál es el grado de informatividad del estudio?

¿Existe una buena correlación genotipo/fenotipo?

DIFERENCIAS ENTRE POLIMORFISMO Y MUTACIÓN 99.9% 0.1% 94% 6%

TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia

-----AGA C TAGAC A TT--- -----AGA T TAGAC C TT----

Polimorfismo de longitud

-----(GATA)(GATA)(GATA)--- -----(GATA)(GATA)--- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----

A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

¿Cómo se transmiten los caracteres hereditarios de generación en generación?

Padres Hijos

La Herencia de los Genes. La Fecundación

+ n ESPERMATOZOIDE

+

n ÓVULO 23 CROMOSOMAS 23 CROMOSOMAS = HIJO 2n Organismo unicelular. Embrión

23 PARES DE CROMOSOMAS

GAMETAS MASCULINAS

La herencia de los genes

Gen de “la bondad” GAMETAS FEMENINAS

Gen de “la bondad” “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva bondad”

Cada variante se denomina alelo. Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” alelos: “mucha bondad” “mediana bondad” bondad”.

presenta cuatro “poca bondad” “excesiva

“La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la bondad que recibió de sus progenitores .

Gen “La bondad” Gen “La Inteligencia” Gen “La Belleza” Mucha Bondad Mediana Bondad Poca Bondad Excesiva Bondad Variantes Alélicas Gran Inteligencia Inalcanzable Inteligencia Incomparable Inteligencia Extremada Belleza Amigable Belleza Mínima Belleza

En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de la persona y menor será la posibilidad de encontrar dos personas que compartan exactamente las mismas características.

Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la madre y el 50 % heredado del padre .

Los STRs

Locus preciso Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”. El número de repeticiones en que se encuentra se corresponde con un alelo.

De acuerdo a las leyes de la herencia, cada individuo tiene dos alelos, uno heredado de su madre y el otro de su padre Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6 repeticiones entre los individuos.

Pequeñas cantidades de ADN Grandes cantidades de ADN Los dos alelos de un STR de un individuo

10 rep 20 rep

PCR 20 rep 10 rep

Material biológico a partir del cual pueden realizarse los estudios de identidad

.

Óvulo materno + espermatozoide paterno Puede utilizarse cualquier tejido para analizar su ADN.

Infinitas divisiones celulares El niño tiene en todas las células de su organismo la misma información genética que en la célula originaria

P+H+M

Estudio de Paternidad

.

LABORATORIO Toma de muestras: sangre, cepillado bucal o uñas

FORMULARIO Nombre completo Fecha de nacimiento Nro. de Documento Firma

Preparación del ADN de las tres personas P H M

Huella digital Foto

ESTUDIO DE PATERNIDAD EN SECUANCIADOR AUTOMÁTICO

ESTUDIO DE MATERNIDAD

Herencia del Cromosoma Estudio de la Línea Paterna Y

Todas las células femeninas tienen dos cromosomas sexuales X (XX) Todas las células masculinas tienen un cromosoma sexual X y uno Y (XY) Las gametas femeninas (óvulos) llevan siempre un único cromosoma X Las gametas masculinas (espermatozoides) llevan o un cromosoma X o un cromosoma Y

X X + X X + Y MUJER VARON X Y

Herencia del Cromosoma Y

X X X Y X X X Y X Y X X X Y X Y ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO PATERNO Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMA Y

El ADN mitocondrial presenta pequeñas regiones diferentes entre las personas

mitocondrias núcleos espermatozoide + óvulo fecundación Primer célula embrionaria que originará todo el embrión

DNA MIT.5

DNA MIT.5

Herencia Mitocondrial

Estudio de la Línea Materna

DNA MIT.1

DNA MIT.2

DNA MIT.1

DNA MIT.1

DNA MIT.3

DNA MIT.1

DNA MIT.4

DNA MIT.1

POLIMORFISMO DE UN GEN Está dado por las diferentes variables en que se presenta en la población.

TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia

-----AGA C TAGAC A TT--- -----AGA T TAGAC C TT----

Polimorfismo de longitud

-----(GATA)(GATA)(GATA)--- -----(GATA)(GATA)--- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----

A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN. DIFERENTES ALELOS EN LA POBLACIÓN

PROYECTO GENOMA HUMANO A partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha determinado que existen aproximadamente 30.000 genes. Se encontraron más de 6.000.000 sitios con SNPs Pero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas de un gen polimórfico se relacionan con características particulares de las personas. AAA C CGG Bondad alta AAA A CGG Bondad media TTT G GCC TTT T GCC Proyecto Genoma Humano GWAS (Genomic wide association studies)

Farmacogenética

Farmacogenética: reducción de riesgos de la terapia

Comparación de riesgos fatales

1 en 10 7

Incremento del riesgo fatal (anual)

1 en 10 6 1 en 10 5 1 en 10 4 1 en 10 3 1 en 10 2 Electrocución Accidente aéreo Asesinato Accidente de

Farmacogenética

coche

Reacción fatal frente al fármaco prescrito

Fuente: Consumer Reports

El genotipo: impacto significativo en el metabolismo de fármacos

Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador

Fenotipo metabolizador Genotipo

Ultrarrápido Eficiente Intermedio Lento Actividad normal Activida d reducida no actividad Conc.

Tipo de respuesta a dosis típicas = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo

Tiempo

= Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo

Consecuencias de un polimorfismo genético: La presencia de uno u otro polimorfismo PUEDE RESULTAR INDIFERENTE.

Si afectan a la secuencia codificante PUEDEN PRODUCIR cambios importantes en la estructura de la proteína.

Si afectan a la secuencia reguladora del gen PUEDEN MODIFICAR su expresión.

Los polimorfismos genéticos también llamados variaciones genéticas se relacionan, entre otras cosas, con el metabolismo de los medicamentos antineoplásicos e influyen en su toxicidad y respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer.

TIOPURIN METIL TRANSFERASA: TPMT

Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Gene

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Enzyme Activity Levels in 300 Caucasian Patients c a

low

b

medium

TPMT Enzyme Activity

high

(TPMT) Polymorphism affects

Each Child Gene for TPMT has A common variant that Causes low activity, High levels of 6MP Metabolites

0

DNA incorporation

Leukemia

14

:567-72, 2000 Relling & Dervieux Nature Ca Rev 2001;1:99-108 Inherited differences in Metabolism 10 8 wt/wt 6 4 2 0 0 m/m 5 wt/m 10 15 20 TPMT Activity 25 30 2000 Inherited differences In drug levels 1000 0 Mut/Mut Wt/Mut Wt/Wt  myelosuppression  risk secondary cancer  toxicity  risk of relapse

UDP-glucuronosiltransferasa UGT1

Drogas que presentan en sus prospectos la recomendación por la FDA De estudio farmacogenético antes de medicar.

ENZIMA UDP-glucuronosiltransferasa POLIMORFISMO FARMACO Secuencias TA repetidas Irinotecan UGT1 Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DPD) Mutación Puntual Fluoropirimidinas CONSECUENCIA Inestabilidad proteica. Diarrea, mielo depresión.

Neurotoxicidad, mielo depresión.

http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm

REACCIÓN AL MEDICAMENTO Nombre del medicamento Abacavir Antibióticos aminoglucósidos Cafeína Carbamazepina Clopidogrel Metotrexato Análisis genético para: Hipersensibilidad Pérdida auditiva Metabolismo Hipersensibilidad Resultados del análisis El alelo HLA-B*5701 se asocia a mayor riesgo de presentar hipersensibilidad al abacavir.

Polimorfismo asociado a la pérdida auditiva como consecuencia del tratamiento con antibióticos amigo glucósidos.

Polimorfismo asociado a ser metabolizador lento de la cafeína, y riesgo de toxicidad y riesgo de sufrir un infarto cardíaco.

El alelo HLA B*5702 está asociado a la hipersensibilidad a la carbamazepina.

Polimorfismo asociado a la respuesta.

Metabolismo Toxicidad Polimorfismo asociado a riesgo de toxicidad inducida por el metotrexato.

LAS PREDICCIONES YA ESTÁN HECHAS

QUÉ FALTA PARA APLICAR ESTOS ESTUDIOS PREVIO AL TRATAMIENTO?

Pacientes con genotipos tratados de acuerdo a las predicciones.

Pacientes sin genotipos y tratamiento clásico La farmacogenética, mejora la efectividad del tratamiento?

EJEMPLOS DE ASOCIACIONES GENÉTICAS GEN PPARG (PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GENE) -El alelo C codifica para una Prolina en el codon 12 en lugar de una Alanina.

-PPARG asociado a la reducción de el peso corporal en respuesta a la restricción calorica.

-Polimorfismo Pro12Ala asociado a Sindrome Metabolico, Resistencia a la Insulina y diabetes tipo 2 en población sana. GEN APOA-2: GEN DE LA APOLIPOPROTEINA A2 -Presencia de una C en lugar de una T en el promotor del gen.

-Genotipo C/C : -Influye en la obesidad y el riesgo cardíaco.

GEN ADIPOQ: GEN DE LA ADIPONECTINA -Presencia de una G en lugar de una A en la posición -11391 G/A, en el gen ADIPOQ .

-Tendencia a recuperar el peso perdido inmediatamente.

-Riesgo de Resistencia a la insulina y syndrome metabolico.

-Alelo A da protección a la recuperación del peso luego de 32-60 semanas luego de dieta baja en calorías.

GEN MCM6: minichromosome maintenance complex component 6.

-El a alelo C en lugar del T en la posición -13910 del gen MCM6.

-Influye sobre el gen LCT y se asocia a hipolactasia o intolerancia a la lactosa.

EJEMPLO / REACCIONES A ALIMENTOS INTOLERANCIA A LA LACTOSA La intolerancia a la lactosa es la capacidad de digerir la lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche y los productos lacteos. Esta condición se debe a la falta de una enzima llamada lactasa. La variante genética rs4988235 está situada cerca del gen de la lactasa (LCT), en el gen MCM6, y se ha demostrado que nivela los niveles de lactasa en el organismo . Las personas con el genotipo C/C (marcador genético rs4988235) tienen una “Mayor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa, mientras que las personas con otro genotipo tienen una “Menor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa.

Esta variante se ha asociado con la intolerancia a la lactosa en estudio de personas caucásicas, mientras que otras variantes podrían tener un papel importante en otros grupos étnicos.

SU RESULTADO MAYOR PROBABILIDAD Las personas con su mismo genotipo tienen un probabilidad mayor de ser intolerantes a la lactosa y pueden sufrir efectos secundarios al ingerir lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche.

GENES RELACIONADOS Gen analizado MCM6-rs498835 Su Genotipo C/C Valor Científico *** *

www.SNPedia.com

[ PMID 18959602 ]

PMID

, acrónimo de «PubMed Unique Identifier», es un número único asignado a cada cita de un artículo de revistas biomédicas y de ciencias de la vida que recoge PubMed.

PubMed

es un motor de búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y resúmenes de artículos de investigación biomédica. Ofrecido por la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos hasta la actualidad.

como parte de Entrez . MEDLINE tiene alrededor de 4.800

revistas publicadas en Estados Unidos y en más de 70 países de todo el mundo desde 1966

EJEMPLO / NECESIDADES NUTRITIVAS VITAMINA B12 En múltiples estudios genéticos se ha identificado a un marcador en el gen FUT 2, que está asociado a niveles bajos de Vitamina B12 en sangre. Esto se puede deber a una absorción deficiente de la vitamina en el intestino. Se recomienda a las personas con genotipos G/G o A/G “ Ajustar el consumo ” porque es probable que tengan niveles bajos de Vitamina B12. El consumo de cereales enriquecidos con vitamina B12 puede ayudar a obtener niveles adecuados, sobre todo en personas mayores de 50 años.

Las personas con este mismo genotipo tienen mayor probabilidad de presentar niveles mas bajos de vitaminas B12 en sangre. Se puede ajustar el consumo de la vitamina B12 poniéndole ingiriendo alimentos ricos en vitamina B12.

GENES RELACIONADOS Gen analizado FUT2-rs602662 Su Genotipo A/G Valor Científico *** *

ASOCIACIÓN ENTRE LOS NÍVELES DE VITAMINA B12 EN PLASMA CON LOS GENOTIPOS DEL GEN FUT2.

(MUJERES DEL GWAS Y REPLICA EN OTROS ESTUDIOS)

SNP Association by Study EDAD rs602662GWAS

NHS CGEMS 59

N FRECUENCIA DEL ALELO CANTIDAD PG/ML

Gly=0.49

Ser/Ser A/A AJUSTE EL CONSUMO Ser/Gly G/A 1,658 489.82

418.67

Gly/Gly G/G 417.05

ESTIMADO (S.E.) P-VALOR

-0.08(0.01) 6.54x10

-10

Total (Gwas+ Grupo replica) 487.72 413.35 413.52

-0.08

3.52x10

-15

Ante la necesidad de un estudio genético: -La información siempre debe estar mediada por el médico.

-Es el médico quien debe asesorar al paciente respecto de las conveniencias y los riesgos de someterse a una prueba genética.

-Explicar muy bien el significado de un estudio de asociaciones. -No caer en la GENOMANÍA. -Recordar que la genética es sólo una parte de lo que somos fenotípicamente y que el medio ambiente juega un rol importantísimo tanto en la expresión de nuestros genes (epigenética) como en los riesgos de desarrollar enfermedades complejas (cáncer, diabetes, enf. Cardíaca, etc).