Transcript Cinética enzimática - Molar - Universidade Católica Portuguesa
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Sumário:
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Princípios básicos: velocidade de reacção
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
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Concentração de enzima
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Concentração de substrato
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equação de Michaelis-Menten
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Determinação dos parâmetros cinéticos: equação de Lineweaver-Burk
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pH
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Temperatura
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico
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As isoenzimas e as doenças do coração
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diagnóstico do enfarte do miocárdio UBA1- BQ
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Princípios básicos: velocidade de reacção
A velocidade da reacção enzimática (V): é medida pela quantidade de produto (ou produtos) formado por unidade de tempo.
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Velocidade inicial
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Velocidade num instante t1 UBA1- BQ
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Princípios básicos: velocidade de reacção
A velocidade é mais elevada no início e vai decrescendo com o tempo. Isto acontece essencialmente porque:
P v o reacção inicial (mais elevada) S E P reacção mais lenta (i) com o aumento de [P], começa a dar-se também a reacção inversa, P → S (ii) [S] vai decrescendo ao longo do tempo de reacção, o que também diminui a velocidade da reacção directa S → P.
(iii) se a reacção for muito prolongada, começa a haver desnaturação da molécula enzimática. Tempo (t) Para evitar estes problemas, utiliza-se sempre a velocidade inicial (v o ), uma vez que se estará então a contabilizar apenas S → P, com [S] conhecida e [P] = 0:
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: A- Concentração de Enzima
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Traçando um gráfico com as velocidades obtidas nestas experiências, em função das concentrações de enzima, verificamos que a variação é linear
[E]
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato
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A relação entre a concentração de substrato e as velocidades iniciais obtidas é hiperbólica.
V 0 [S]
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato
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K M = concentração de S para a qual a velocidade da reacção é metade da velocidade máxima (V max ) ( metade de todos os locais activos estão ocupados)
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max )
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A equação que traduz o comportamento da curva de v o Michaelis-Menten) é a equação de Michaelis-Menten: em função de [S] (curva de Permite, após determinação experimental das variações de v em função de [S], obter o valor de V max e calcular KM
S 1 : maior afinidade S 2 : menor afinidade
... K M é uma medida da afinidade da enzima para o substrato (= 1/K M ) (K M elevado → afinidade baixa)
K M1 K M2 Universidade Católica Portuguesa
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max )
Devido às dificuldades de cálculo de K M através da equação de Michaelis -Menten, procurou-se obter uma representação linear da relação entre V 0 traduzida por uma recta...
e S que pudesse ser UBA1- BQ
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max )
Exemplo
velocidades iniciais de reacção da fosfatase ácida a várias concentrações de glicerol, [S].
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max )
Como medir a eficiência de uma enzima em dadas condições???
...usando a razão K cat /K M (K cat –velocidade de catálise máxima)
Kcat=Vmax/Et
(Máxima) Perfeição enzimática
Algumas enzimas aproximam-se destes valores...
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max )
Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução UBA1- BQ
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH
Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima As enzimas podem apresentar dois tipos de curva de actividade em função do pH UBA1- BQ
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH
possível efeito duma alteração de pH ao nível do centro activo de um enzima:
A. pH óptimo
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B. pH inferior ao óptimo (maior [H+])
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH
Nem todas as enzimas têm o mesmo pH. Por exemplo, a pepsina, que hidrolisa proteínas a péptidos no estômago, extremamente ácido, e a tripsina, que hidrolisa péptidos a aminoácidos nas condições alcalinas do duodeno, têm óptimos de pH adaptados ao seu ambiente
Em laboratório, quando estudamos a actividade de um enzima, temos que ter o cuidado de incluir um sistema tampão no meio de ensaio, de modo a estabilizar o pH;
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito da temperatura UBA1- BQ
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico: Enzimas plasmáticas:
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Libertadas para o plasma por células especificas (pequeno nº) (o figado liberta zimogénios envolvidos na coagulação)
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Libertadas para o plasma durante o “turnover” celular (grande nº) (s seus níveis mantêm-se extremamente constantes e em equilibrio) Deste modo, determinando as variações da actividade enzimática no plasma sanguíneo, podem-se diagnosticar doenças
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
Algumas enzimas apresentam apenas actividade elevada em órgãos específicos O aumento dos níveis plasmáticos dessas enzimas reflecte danos nesses tecidos
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
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As isoenzimas e as doenças do coração
… têm a mesma função mas pequenas diferenças em aminoácidos Podem ser separadas por electroforese •O padrão de isoenzimas plasmáticas pode servir para detectar o local da lesão
LDH e CK
Especialmente úteis quando o electrocardiograma é difícil de interpretar (episódios anteriores de doenças cardíacas)
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
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As isoenzimas e as doenças do coração: diagnóstico do enfarte do miocárdio.
•O miocárdio é o único tecido que possui + de 5% de CK2 (MB) → presença MB = enfarte do Miocárdio •CK2 (MB) → Pico de actividade às 24 h •LDH → Pico de actividade das 36 às 40 h •Importante no diagnóstico em pessoas que dão entrada após 48 h o enfarte do miocárdio •A presença de níveis elevados de CK3 (MM) é indicativa de danos musculares do miocárdio.
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