Transcript Идентификация маркеров каннабимиметиков в моче методом

Идентификация маркеров
каннабимиметиков
в моче методом ВЭЖХ-МС-МС
высокого разрешения
Лабутин Андрей
Томский областной
наркодиспансер
Методы доказательства стр-ры
соединений




1. хромато-масс-спектрометрия
2. УФ-, ИК-спектроскопия
3. ЯМР спектроскопия
4. встречный синтез (использование
стандартных образцов)

Применение тандемной масс-спектрометрии
пожалуй является единственным методом
доказательства структуры метаболитов СК, по
причине крайне незначительного количества
вещества и сложной матрицы, что делает
невозможным применение таких методов как
ЯМР и ИК, встречный синтез, как метод
доказательства стр-ры, также недоступен в
условиях химико-токсикологических
лабораторий, как по организационным так и
по юридическим причинам.
Преимущества метода ВЭЖХ-мс-мс
для химико-токсикологического
анализа



1. мягкие варианты ионизации,
позволяющие получить молекулярный
(МН+) ион
2. лучшая очистка от посторонних
шумов аналитического сигнала
3. получение дополнительной
структурной информации о веществе.
Основные превращения
каннабимиметиков в организме


O


N
F



- моногидроксилирование (изменение массы на 15.9949
а.е.м),
- дигидроксилирование (изменение массы на
31.9898а.е.м),
- замещение фтора на гидроксил (изменение массы на
1.9957 а.е.м),
- карбоксилирование (изменение массы на 29.9741
а.е.м, и 11.9835 а.е.м для фторалкилированных
психоактивных веществ),
- карбоксилирование с укорочением углеродной цепи на
2 атома углерода (изменение массы на 1.9429 а.е.м, и
16.0477 а.е.м для фторалкилированных психоактивных
веществ).
- дезметилирование (изменение массы на 14.0156 а.е.м)
- гидролиз сложноэфирной связи и гидролиз
терминальных амидных групп (молекулярная масса
метаболита определяется исходя из структуры
соединения, находящегося в незаконном обороте,
метаболиты которого требуется определить в
биосредах)


Таким образом, как сами каннабимиметики, так и их метаболиты
зачастую имеют общие фрагменты в структурных формулах, и
похожие схемы распада в источнике ионизации и камере
соударений масс-селективного детектора, что ведет к тому в
спектре метаболитов и нативных веществ присутствуют
идентичные по структуре ионы, несущие информацию о
структуре исходного соединения.
Критерием присутствия идентичных ионов в спектрах нативных
каннабимиметиков и их метаболитов является наличие
идентичных ионов во вторичных спектрах исследуемых ионов,
полученных на тандемном масс-спектрометре, притом разница в
атомных единицах массы не должна превышать 5ppm для ионов
предшественников и 5ppm для ионов-продуктов
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков

1. поиск на хромато-массспектрограмме образца с помощью
программного обеспечения прибора
осколочных ионов в мс-мс спектрах,
соответствующих наиболее
распространенным фрагментам
известных психоактивных соединений.
(таблица 1)
Таблица характерных
осколочных ионов (фрагмент)
Точная масса
фрагмента (а.е.м)
Структурная формула
фрагмента
O
145,0396
+
C
N
N
H
O
144,0443
+
C
N
H
O
217,0608
+
C
N
N
OH
O
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков

2. поиск на хромато-масс-спектрограмме
образца с помощью программного
обеспечения прибора ионов, которые
соответствуют по массе протонированным
ионам метаболитов наиболее известных
психоактивных соединений, в том числе
входящих в Перечень наркотических средств.
При этом молекулярная масса возможного
метаболита определяется исходя из наиболее
распространенных путей метаболизма,
описанных в литературе
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков

3. вторичные масс-спектры молекулярных
ионов (МН+) обнаруженных в п.2 должны
содержать ионы, соответствующие по брутто
формуле ионам (при расхождении по мол.
массе не более 5ррм), образующимся в ходе
мс-мс эксперимента с нативными веществами
(как с учетом метаболитических изменений
массы приведенных выше, так и без них),
либо каким-либо ионам, приведенным в
таблице 1, либо иным, известным из
литературных данных.
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков

4. вторичные масс-спектры осколочных
ионов образующихся в ионном
источнике при повышенном
напряжении на фрагменторе от
нативных соединений и от метаболитов,
должны содержать аналогичные
фрагментные ионы (при расхождении
по массе не более 5ррм)и иметь
аналогичный характер фрагментации.

Для целей установления спектральных
характеристик нативных соединений (точные
молекулярные массы, мс-мс спектры высокого
разрешения, пути фрагментации),
предполагается регулярно исследовать
образцы новых психоактивных веществ на
момент изъятия не относящихся к
наркотическим средствам, изымаемые из
незаконного оборота органами ФСКН и МВД
Пример 1. Поиск метаболитов
вещества АМ(N)-2201 в
биологическом образце (моче).
-F
+COOH
+OH
O
N
N
F





Исходя из структуры соединения с учетом
изложенных в п.п. 2 данных можно предположить
что протонированные формы метаболитов будут
иметь следующие мол.массы (приведены только
наиболее вероятные метаболиты):
- 377,1659 (моногидроксиметаболит)
- 373,1547 (С5-карбоксиметаболит)
- 359,1754 (С5-ОН - метаболит - продукт замещения
фтора гидроксигруппой)
- 345,1234 (продукт карбоксилирования с
укорочением углеродной цепи на 2 атома углерода)
Для указанных масс получены следующие
хроматограммы (даны в наложении, окно поиска
5ррм)
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного
моногидроксиметаболита получен следующий мс-мс спектр
O
+
N
N
F
O
+
N
N
O
+
OH
CH2
O
OH
O
+
N
N
H
N
N
H
H
+
N
N
H
CH2
Для пика соответствующих протонированной форме вероятного С5карбоксиметаболита получен следующий мс-мс спектр
O
+
O
+
N
N
O
OH
O
O
N
N
N
N
+
CH2
Ионы
с m/z 217,0966 и 227,0811 в масс-спектре С5-карбокси
метаболита могут быть объяснены элиминированием
соответственно молекулы воды и карбонильной группы из
соответствующего фрагмента метаболита.
+
O
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного
С5-гидрокси метаболита получен следующий мс-мс спектр
O
+
N
N
CH2
O
O
+
+
N
N
N
N
H
OH
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного
продукта карбоксилирования с укорочением углеродной цепи на 2
атома углерода получен следующий мс-мс спектр
+
O
N
N
OH
O
O
+
O
+
O
+
N
N
H
N
N
H
H
Фрагментация нативного соединения










Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №1
3-Нафтоилиндазолы и 2-нафтоилбензимидазолы –
новые группы синтетических каннабиноидов: химическая
структура, аналитические характеристики и идентификация
первых представителей в составе курительных смесей,
а также некоторых метаболитов в моче
© Шевырин Вадим Анатольевич, Гофенберг Мария Александровна,
Мелкозеров Владимир Петрович, Неверо Александр Сергеевич,
Ельцов Олег Станиславович, Куприянова Ольга Всеволодовна
и Моржерин Юрий Юрьевич


Как видно полученные данные m/z вторичных
ионов прекрасно совпадают с расчетными
данными, так как разница в массовых числах
наблюдаемых вторичных ионов не превышает
5ррм от их рассчетных значений.
Кроме того общий характер фрагментации
веществ совпадает с описанной в литературе
фрагментацией нативного соединения.
Также была сравнена фрагментация ионов 233.1085 и 145,0396, полученных от
предполагаемых метаболитов и от нативных веществ при повышенном напряжении
фрагментора

Как видно из рисунков, в полученных мс-мс спектрах
присутствуют пики, соответствующие частям
структур наиболее широко распространенных
синтетических каннабимиметиков (как претерпевших
метаболитические изменения, так и нет), также
фрагментация основных ионов в масс-спектрах
метаболита и нативного вещества – совпадают (ионы
233.1085 и 145,0396). Кроме того, по причине
совпадения посчитанных точных масс метаболитов и
масс протонированных молекулярных ионов,
определенных в ходе исследования можно сделать
вывод о наличии метаболитов вещества AM(N)-2201
в исследуемом образце.
Пример 2. Поиск метаболитов
вещества AB-PINACA в
биологическом образце (моче).
CH3
H3C
NH2
O
NH
O
N
N
CH3
Хрома-масс-спектромма осколочных ионов мс-мс
фрагментации (сверху для ионов 215,1179, снизу для
145,0383) окно поиска 3ррм

установлено что эти ионы образуются из иона-прекурсора
с m/z 332.1968 в спектре которого наряду с указанными
ионами также присутствует ион 286.1906

Анализируя литературные данные и приведенный масс-спектр, можно
сделать вывод, что данное соединение с m/z 332.1968 содержит 1-Нпентилиндазольный фрагмент (ионы с m/z 215.1179 и 145.0396),
который, по всей видимости, принадлежит иону с m/z 286.1906, и, в
свою очередь, образуется из псевдомолекулярного ([M+H]+) иона с
m/z 332.1968. Очевидно, что переход 332.1968→286.1906
соответствует потере карбоксильной группы и протона (–46,0062
а.е.м), а структура обнаруженного соединения должна выглядеть
следующим образом:
CH3
H3C
OH
O
NH
O
N
N
CH3



Данное соединение является метаболитом
синтетического каннабиметика AB-PINACA (MBA(N)-018,
N-(1-карбамоил-2-метилпроп-1-ил)-1-пентил-1H-индазол3-карбоксамид) и его образование происходит в ходе
гидролиза терминальной амидной группы исходного
соединения.
Для подтверждения предложенной структуры
проводилась серия анализов образцов мочи, содержащих
синтетический каннабиметик AB-PINACA, при
повышенном напряжении на фрагментаторе массспектрометра, что позволило получить основные
фрагментарные ионы на источнике. Использование этого
подхода позволило получить больше структурной
информации за счет большего количества различных
ионов.
При сравнении фрагментаций ионов 215.1179, и
286.1914, взятых от нативного вещества и от вероятных
метаболитов, можно сделать вывод о правильности
изложенного выше предположения
Сверху мс-мс спектр иона 215 от нативного вещества, снизу мс-мс
спектр от иона 215 предположительного метаболита
Сверху мс-мс спектр иона 286 от нативного вещества, снизу мс-мс
спектр от иона 286 предположительного метаболита



Для поиска метаболитов синтетических каннабиметиков
реализованы два подхода:
– поиск метаболитов известного соединения с
использованием масс-спектра высокого разрешения
второго поколения ионов вероятных метаболитов,
который обеспечивает высокую надежность
определения;
– целевой поиск продукт-ионов, характерных для
наиболее распространенных классов психоактивных
соединений. Данный подход является более
универсальным и позволяет обнаружить соединения,
претерпевшие более глубокие изменения в ходе обмена
веществ (например, гидролиз эфирных или амидных
связей), за счет возможности установления значения
точных масс всех ионов, включая ион-прекурсор, что в
совокупности со знанием масс некоторых
характеристичных фрагментов, их структур и других
литературных данных позволяет сделать вывод о
наличии и предполагаемой структуре метаболитов
психоактивных веществ в анализируемом образце.

Для повседневной работы ПО прибора
позволяет вести библиотеку спектров
точных масс вторичных ионов, с
возможностью автоматизировнной
обработки хроматограмм, что
освобождает от необходимости каждый
раз проводить работу по
идентификации соединений заново.
Пример автоматизированного библиотечного поиска