Transcript Paper Chromatography - materi-kuliah

Nina Salamah, MSc., Apt
Pendahuluan
 Penggunaan bahan alam khususnya
tanaman dalam pengobatan sudah
berlangsung lama
 Trend “back to nature” : produk herbal
meningkat
 Metode Farmakope: Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT)
Kromatografi
suatu teknik pemisahan campuran menjadi
komponennya berdasarkan perbedaan migrasi
masing-masing komponennya dalam fase diam
akibat pengaruh dari fase gerak
• Analyze
Separate
• Identify
• Purify
Mixture
Components
• Quantify
Illustration of Chromatography
Stationary Phase
Separation
Mobile Phase
Mixture
Components
Components
Affinity to Stationary
Phase
Affinity to Mobile
Phase
Blue
----------------
Insoluble in Mobile Phase
Black


Red


Yellow

        
Kromatografi Lapis Tipis
 Kromatografi padat-cair
 Kromatografi planar
 Fase diam berupa lapisan tipis pada permukaan datar
di atas pendukung yang sesuai
 Keunggulan dibanding KCKT: mudah, sederhana,
murah, cepat
 Kekurangan dibanding KCKT: daya pemisahan dan
sensitivitas lebih rendah, terpengaruh lingkungan
Komponen penting pada analisis
dengan KLT
 Peralatan (chamber)
 Fase Diam
 Fase gerak
 Aplikasi sampel
 Pengembangan
 Deteksi bercak
Fase Diam
Fase diam pada KLT berupa fase yang polar (fase normal)
maupun fese non polar (fase terbalik).
Fase normal
1. Silica gel
Merupakan silica yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit
asam, fase ini lebih banyak digunakan. Untuk memperkuat
pelapisannya pada pendukung,
silika gel ditambah gips
(Kalsium sulfat) sehingga dikenal dengan silica gel G.
Sebagai pendukung lapisan tipis digunakan kaca, dengan
ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20, atau 5 x 10 cm. Pendukung yang
lain berupa lembaran aluminium,
atau plastik dengan
ukuran scperti diatas, yang umumnya dibuat oleh pabrik.
 Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa
flouresens, agar bila disinari dengan sinar UV
berflourosensi atau berpendar, sebingga dikenal
dengan silica gel GF254, yang berarti silica gel
dengan flouresen yang berpendar pada 254 nm
 2.Alumina, (aluminium oksida)
 Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih jarang
digunakan, bila akan digunakan diaktifkan kembali
dengan pemanasan. Alumina yang digunakan
sebagai fase diam untuk KLT umumnya yang bebas
air, schingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih
tinggi.
 3. Kiselguhr
 Sebenarnya merupakan asam silica yang amorf, berasal dari
kerangka diatomeae, maka lebih dikenal dengan nama tanah
diatome, kurang bersifat adsorptif dibanding silica.
 4. Magnesium silicat
 Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan floresil,
hanya digunakan bila adsor ben atau penjerab lain tidak
dapat digunakan.

 5 Selulose
 Polaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai pemisah sccara
partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk Icmpeng.
Keduanya masih sering dipakai misalnya untuk pemi sahan
flavanoid.
 Fase diam
 Umumnya digunakan silika
 Dapat ditambahkan pengikat dan indikator fluoresensi
 Mekanisme dominan: adsorbsi kadang partisi
 Fase gerak/eluen/pelarut
 Berdasarkan polaritas
 Biasanya campuran
 Studi pustaka dan coba-coba
 Prinsip: like dissolves like
 Senyawa polar lebih tertahan oleh fase diam
 Senyawapolar lebih mudah larut dalm fase gerak yang polar
Simbol-simbol Pelat KLT
 Si atau Sil








Mengandung silika
60
Ukuran pori
F atau UV Mengandung indikator fluoresensi
254 atau 366 Setelah simbol F atau UV untuk menunjukkan
panjang gelombang eksitasi indikator fluoresensi
G
Pengikat gipsum (kalsium sulfat)
H atau N
Tanpa pengikat
RP
Reversed Phase, silika yang dimodifikasi dengan
hidrokarbon
2, 8, 18
Panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika
P
Untuk preparativ
Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas pelarut
Aplikasi sampel
 Totolan bercak sekecil mungkin
 Biasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak menyebar dan
bertumpuk
 Digunakan pelarut sampel yang bisa melarutkan
sampel dengan baik, tetapi mudah menguap dan daya
elusinya kecil
 Secara manual/otomatis
 Dapat digunakan pipa kapiler,
mikropipet, mikrosiring
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Deteksi Bercak
 Berwarna atau tidak
 Dengan lampu UV 254/366 nm
 Jika menggunakan pelat KLT F: bercak yang tidak
berfluoresensi terlihat sebagai pemadaman (gelap)
pada latar belakang hijau/biru
 Dengan penampak bercak
 Disemprot/dicelup/diuapi
 Destruktif/tidak
 Umum/selektif
Visualization (Detection of spots):
A- Universal methods:
1- Destructive methods:
The plated are sprayed with corrosive reagents and then heated
in oven where organic compounds will give charred spots. After
this treatment the materials can not be recovered.
e.g. Anisaldehyde / H2SO4
Vanillin / H2SO4
2- Non – Destructive methods:
In these methods the materials can be recovered.




Day light for colour compounds.
UV light for fluorescent compounds (conjugated double
bonds).
I2 vapour for any compounds contain at least one double
bond
Spray with water where organic compounds appear as
white opaque spots.
B- Specific Methods:

These reagents are used for the detection of certain
classes of compounds. They are usually
destructive.

Dragendorff΄s reagent for Alkaloids.

Ferric Chloride (FeCl3) for phenolic compounds.

Aniline phthalate for sugars.

Ninhydrine for nitrogenous
Amines, Amino acids.
compounds
as
Tabel Beberapa penggunaan pelacak bercak pada
kromatografi kertas
Nama
pereaksi
Analit
Nama
pereaksi
Analit
l.Sinar UV254 nm
9. Pereaksi
Tur. morfin
Senyawa flouresen
Marquis
Seny.Amin
2
Fenol, aril
 lodoplatinat
ter/kuaterner
10. Peraksi Millon amin Ikatan
Sebyawa
fiuoresen
Amin
ter/kuater.
Turunan
karbamat
3.Pereaksi
furfural
Turunan
Karbamat
11 .KMn04
+
tak jenuh
HeterosikUk amin kanabinol, sulfonamida
as.sulfet
4.Pereaksi
Simon Heterosiklik
12 .Ninhidrin
As. amino
Alkaloid/Amin
kuar Ter.Heksa(penta
klorfenol) Ikatan
amin
13. Nitroso-naftol primer
rangkap, seny.organik
Ergot

5.DABdlm etanol
Karbinol/Sulfonamid 14. Pereaksi
alkaloid
Mandelin
Turunan
a
6.Dragendorff
ajmalin
Alkaloid/amin kuater, 15. Vanilinas.
Barbiturat
Ter.Heksa/penta
Sulfat
fenetoin,
7. Uap iodium
klorfenol
8. UapNO2
S
Ikatan rangkap/
senyawa organik
22
22
Rate of flow (Rf Value):
Distance traveled by the spots
Rf = ----------------------------------------Distance traveled by the solvent
The Rf of any compound must be less than one.
Solvent front
Distance travelled by
the solvent
Distance travelled by
the spot
Start line
 Tailing in Paper Chromatography:
In some cases instead of getting round spots a Tailed or comet
like spots are obtained leading to overlapping of the spots and
poor resolution.
Tailed or comet like spot
Reasons and solution for tailing problem:
1-Ionic characters of acids and bases when they are
chromatographed under neutral conditions.
Solution: add acids or bases to the developing system.
2-Application of large amounts of material.
Solution: decrease conc. of material.
3-Unproper choice of solvent system.
Solution: change the solvent system.
Application:
1- Qualitative:
 Identification through comparison of the Rf value with that
of Reference material.
 Determination of Complexity of mixtures. That will be
indicated from number of spots.
 Determination the purity of materials.
 Monitoring the progress of Chemical reactions.
 Monitoring of column chromatography.
 Development of finger print TLC for extracts, volatile oils or
pharmaceutical preparation for future identification and
comparison.
In this application plates 5×5, 5×10 cm with thin film of coating
material are usually used.
2- Quantitative:

In this case an accurate volume of samples are applied using
syringes. The dimensions of plates range from 5x10 to 20x20
according to the number pf spots used. The plates are
developed as usual in the chromatographic tanks. After
development the concentration of material can be determined
by:



Spot area measurement: Which is directly proportional to the
conc. of materials.
Photodensitometry: Measure transmittance, reflection or
fluorescence of spots.
Radioactivity: For radioactive material.
These measurements are done using TLC Scanner
connected to computer that perform all calculations.
28
29
Maturnuwun