Transcript Mekanisme Kromatografi Cair

Oleh: Purwadi, M.Si
Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009
Elusi
Kromatografi Cair (KC)
•
Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak
cairan
Bagaimana fase diamnya?
Jawab
Bisa padat bisa juga cair
Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi
Gas hanya 10%, mengapa ?
Karena Kromatografi Cair
1.
Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2.
Tidak ada persyaratan analit harus menguap,
sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik
didih relatif tinggi
3.
Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4.
Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5.
Tidak harus mahal: KLT, KKt
Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak
Kromatografi
Fase gerak gas
Kromatografi
Gas
Fase gerak cair
Krom.
Kolom
KK.
Terbuka
KLT
KK.
Vakum
Krom. KCKT
Kertas
Kromatotron
Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi
jenis peralatan ?
Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti
berbeda dengan KCKT?
Jawab
Jenis peralatan tidak mempengaruhi
mekanisme pemisahan secara
kromatografi Cair
Terkadang mekanisme pemisahan dalam
KLT sama dengan KCKT
ADSORBSI
KCKT
PARTISI
PERTUKARAN ION
KLT
Krom. Kertas
Mekanisme
KROM. ION
PASANGAN ION
Krom Kolom
SIZE EXCLUSION
Kolom
FILTRASI GEL
PERMEASI GEL
Mengapa begitu banyak mekanisme?
Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi
mempunyai bermacam mekanisme?
Jawab
Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu
mekanisme saja
Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
Adsorbsi
Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
partisi
Farktor apa yang mendasari kita memilih satu
mekanisme pemisahan dalam kromatografi?
Jawab
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan
dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin
dipisahkan
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI ADSORBSI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang polar
Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi
Jawab
Anda ingat like disolve like, seperti itulah
mekanismenya
Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase
diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian
Ada campuran analit, dengan
sifat Polar dan lainnya non
polar, maka yang bersifat polar
akan disukai oleh fase diam
(dengan kata lain teradsorbsi
lebih kuat) dibanding analit lain
yang kurang polar.
Analit Lebih
polar
m = fase gerak
s = fase diam (polar)
Cerita mekanisme adsorbsi
Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam,
selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit
tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih
polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga
polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding
analit yang kurang polar.
Sehingga => terjadi pemisahan
Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang
bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar:
misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika
pada KLT atau pun KCKT dll maka
mekanismenya adalah adsorbsi
Kolom HPLC fase normal
 Silica
gel
 Cyano
 Amino
 Diol
: pemakaian umum
: pemakaian umum
: analisa gula
: analisa protein
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
Si
Silica gel
Si
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modifikasi Si
Kasus: Suatu Campuran berisi
Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan
fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai
Rf lebih tinggi??
Jawab
Ikatan hidrogen
Silica gel (polar)
Non-polar
Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut
dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?
kuat
HO
SiOH
SiOH
lemah
OH
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI PARTISI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang Non-polar
Bagaimana prinsipnya:
partisi
Apa yang dimaksud dengan partisi?
Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi
jika analit dimasukkan dalam corong pisah
yang berisi dua cairan yang tidak saling
larut? Analit tersebut setelah terjadi
kesetimbangan sebagian akan masuk ke
cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke
cairan dua.
Apakah bisa fase diam berupa cairan?
Jawab: bisa
Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran
fase gerak?
Jawab: bisa.
Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?
Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam
padatan
Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36
sebagai fase diam?
Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan
padatan silika.
-Si-C18H35
Si
Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase
diam non polar, dan fase gerak polar
Sistem kromatografi dengan menggunakan
fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik
Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi
menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?
A
B
Jawab:
Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar.
Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B
dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi
masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase
gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase
diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan
tertahan lebih lama pada fase diam
Bagaimana interaksi?
Interaksi
hidrofobik
Non-polar
Solven polar
Hidrofobisitas

Jika sampel memiliki
– CH3CH2CH2--- : rantai karbon
–
: gugus aromatis

Hidrofobisitas
Jadi lebih kuat.
Jika sampel memiliki
–
–
–
–
-COOH
-NH2
-OH
X
: gugus karboksil
: gugus amino
: gugus hidroksil
Hidrofobisitas
jadi lebih lemah.
Waktu retensi dan Hidrofobisitas
OH
C18 (ODS)
kuat
OH
lemah
Pengaruh fase diam
C8
Medium
C18 (ODS)
sampel
kuat
C4
sampel
lemah
sampel
Mekanisme pemisahan untuk
melekul ionik
Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk
analit ion?
Kromatografi pasangan ion
Kromatografi penekanan ion
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi Pasangan Ion
Apa dasar pasangan ion?
Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa
mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat
mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi
pengekoran dan atau puncak pecah.
Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara
dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga
mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak
partisi dengan sedikit adsorbsi
Kromatografi Fase Terbalik
dengan pasangan ion
Ion-Pair Reagent
Untuk apa dipasangkan?
Jawab.
Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar.
Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan
fase diam non polar (misal C-18)
Reagen Ion-Pair

Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya:
– Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)

Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:
–
–
–
–
–
–
Butanesulfonic acid sodium salt
Pentanesulfonic acid sodium salt
Hexanesulfonic acid sodium salt
Heptanesulfonic acid sodium salt
Octanesulfonic acid sodium salt
Decanesulfonic acid sodium salt
(C4)
(C5)
(C6)
(C7)
(C8)
(C10)
Ion Pairing
Separation of Carboxylic Acids
Column: Bonded C18
Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1 with TetrabutylAmmonium Hydroxide
Pasangan Ion
Hal yang penting diperhatikan
 Tipe
reagen Ion-Pair
 Konsentrasi reagen Ion-Pair
 pH solven
RCOO- + H+
R-COOH
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+
R-NH3+
(pKa=6.0)
Tipe reagen ion-pair
Hexane Sulfonate
Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine
Pentane Sulfonate
Mekanisme: Penukar ion
Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion
Kekuatan antar ion
R
N+ R
R
Sampel
Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation
SO
3
+ + + +
+
+
Sampel
+
+
+ + + + +
Penukar ion
Lingkungan biologi
(protein, peptide, amino acid analysis)
 Kromatografi ion

– Penukar kation
• Strong Cation Exchange
• Week Cation Exchange
– Penukar anion
• Strong Anion Exchange
• Week Anion Exchange
(SCX)
(WCX)
(R-SO3-)
(R-COO-)
(SAX)
(R4N+)
(WAX)(DEAE)
Hal yang perlu diperhatikan
pada Kromatografi Penukar ion
pH larutan dapar
 Konsentrasi larutan dapar
 Metoda elusi

– Elusi Isokratik
– Elusi gradien pH
– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik
Mekanisme pemisahan
berdasarkan ukuran molekul
Apakah SEC ?
 Size
Exclusion Chromatography
(SEC)
– GPC (Gel Permeation Chromatography)
• terutama untuk sampel polimer
– GFC (Gel Filtration Chromatography)
• terutama untuk sampel biologi
Prinsip SEC
 Tidak
ada kekuatan interaksi
 Perbedaan waktu tempuh
SEC
Fase diam: partikel berpori
 Molekul ber BM besar
 Molekul relatif besar tidak dapat dijebak
oleh fase diam, akibatnya waktu tambat
singkat
 Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase
diam, akibatnya waktu tambat lama

Hubungan antara
Bobot molekul & waktu tambat
Berat molekul (LogMW)
Batas eksklusi
Batas permeasi
Kolom
GPC
Waktu
Kromatografi Afinitas
Pustaka
SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004,
BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A
JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION,
New Jersey.
PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC