Transcript Virus - Corso di laurea in tecniche della prevenzione nell`ambiente e

Virus: struttura e
classificazione
Giovanni Giammanco
Tappe fondamentali per lo sviluppo della virologia animale
Data
Autori
Scoperta
1898
Loeffler e Frosch
1901
Reed e coll.
1908
Ellerman e Bang
1911
Rous
• Filtrabilita’ del primo virus animale,
il virus aftoso
• Dimostrazione del primo virus patogeno
per l’uomo, il virus della febbre gialla
• Dimostrazione che un virus puo’ causare un tumore
solido
• Dimostrazione che un virus puo’ causare leucemia
1931
Woodruff e Goodpasture • Coltivazione di virus nell’embrione di pollo
1949
Enders, Robbins e Weller • Coltivazione del virus polio in colture cellulari
1952
Dulbecco e Voght
1957
1957
1964
Colter e coll.
Isaacs e Lindmann
Baltimore
• Clonazione del virus polio con il metodo delle
placche
• Dimostrazione dell’infettivita’ di’RNA del virus polio
• Scoperta dell’interferone
• Impiego della biologia molecolare nello studio dei
virus
Cellula e virus
virus
Batteri
Cellula eucariotica
100 m
10 m
1 m
0.1 m
(100nm)
0.01 m
(10nm)
Microscopio ottico
Microscopio elettronico
1m = 0,001mm
1nm = 0,000001mm
1A = 0,0000001 mm
Cellule e Virus: quanti geni?
Cellula umana: 30.000
Cellula di lievito: 6.000
Cellula di batterio: 3.000-5.000
Virus: da 3 a 200 (Influenza: 8)
Definizione e proprietà dei virus
Sono agenti filtrabili
Sono parassiti intracellulari obbligati
Possiedono un genoma a RNA o a DNA
Classificazione
•Virus dei batteri
•Virus delle piante
•Virus degli animali
Virus degli artropodi
Virus dei vertebrati
Criteri di classificazione
In successione «gerarchica»:
• tipo di acido nucleico del genoma
• DNA = deossiribovirus
• RNA = ribovirus
• struttura dell'acido nucleico:
DNA
- a doppio o a singolo filamento
- lineare o circolare
RNA
- a singolo o a doppio filamento
- lineare o segmentato
- a polarità positiva o negativa
• strategie replicative
• presenza o meno di involucro pericapsidico
PRINCIPALI COMPONENTI VIRALI
• Core: Acido nucleico più ogni molecola che ne determina la
stabilità
• Capside: Struttura proteica che racchiude l’acido nucleico o il
core
• Capsomero: Unità proteica che, ripetuta, forma il capside
• Nucleocapside: Acido nucleico più capside
• Pericapside o Envelope o Peplos: Involucro lipoglicoproteico
• Peplomeri: Proiezioni superficiali che protrudono dall’ envelope
• Virione: Particella virale completa
CAPSIDE
Composto da polipeptidi assemblati secondo due
possibili simmetrie:
ICOSAEDRICA
O
ELICOIDALE
Simmetria icosaedrica
Icosaedro=solido a 20 facce
Assi di simmetria dell’icosaedro
Ricostruzione tridimensionale di capsidi icosaedrici
di diversi virus animali
Simmetria elicoidale
INVOLUCRO PERICAPSIDICO
O ENVELOPE
Composto da lipoglicoproteine
- proteine virus-codificate
- lipidi e carboidrati cellulari
Rappresentazione schematica di un virus con
envelope
Peplomeri
Acido nucleico
Envelope
Capside
VIRUS A SIMMETRIA COMPLESSA
Classificazione dei virus
Virus a DNA
Classificazione dei virus
Virus a RNA
Caratteristiche dei virus sprovvisti di
involucro pericapsidico (virus nudi)
Composizione chimica : proteine, acidi
nucleici
Proprietà
Sono resistenti:
• All’essiccamento
• Agli acidi
• Ai detergenti
• Vengono rilasciati per lisi della cellula infetta
Caratteristiche dei virus sprovvisti di
involucro pericapsidico (virus nudi)
Conseguenze
Possono :
• Essere trasmessi facilmente
• Essere essiccati e mantenere l’infettività
• Resistere al pH acido dello stomaco
• Resistere al trattamento con detergenti
• La risposta immunitaria protettiva è
prevalentemente umorale
Caratteristiche dei virus con involucro
pericapsidico (virus inviluppati)
Composizione chimica : proteine, lipidi,
glicoproteine, acidi nucleici
Proprietà
Sono inattivati da:
• Acidi
• Detergenti
• Essiccamento
• Calore
• Sono rilasciati per gemmazione o per lisi cellulare
Caratteristiche dei virus con involucro
pericapsidico (virus inviluppati)
Conseguenze
• Non possono sopravvivere nel tratto
gastrointestinale
• Mantengono la loro infettivita solo in ambiente
umido
• Vengono trasmessi prevalentemente per contatto
diretto
• Non devono necessariamente uccidere la cellula
per diffondere ed infettare altre cellule
• La risposta immunitaria protettiva e sia umorale
che cellulare
I virus epatitici
Caratteristiche distintive
Moltiplicazione virale
• Avviene all’interno della cellula infetta
(parassita intracellulare obbligato)
• Necessita di cellule sensibili, provviste
di recettori per il virus
• Necessita di cellule permissive
altrimenti si avrà una infezione abortiva
o restrittiva (latenza)
Fasi del ciclo moltiplicativo virale
Adsorbimento (legame recettore cellulareantirecettore virale)
Penetrazione
Denudamento ed esposizione dell’acido nucleico
virale
Sintesi macromolecolari virus-specifiche
Montaggio (assemblaggio) dei virioni
neoprodotti e maturazione
Rilascio
La replicazione nei virus animali
FATTORI DETERMINANTI LA
MALATTIA VIRALE
NATURA DELLA MALATTIA
• TROPISMO TISSUTALE DEL VIRUS
• PERMISSIVITA' CELLULARE
GRAVITA' DELLA MALATTIA
•
•
•
•
•
CAPACITA' CITOPATICA DEL VIRUS (VIRULENZA)
STATO IMMUNITARIO DELL'OSPITE
ENTITA' DELL'INOCULO
CONDIZIONI GENERALI DI SALUTE DELL'OSPITE
ETA'
Infezione localizzata
Infezioni sistemiche
Diffusione di HAV nel soggetto infetto
Meccanismi evolutivi dei
virus
L’esempio del virus influenzale
Virus dell’influenza
Rappresentazione
schematica del virus
dell’influenza A
Due glicoproteine di
superficie, emoagglutinina
(HA) e neuraminidasi (NA)
e la proteina M2 (canale
ionico) sono incluse
nell’envelope virale.
Influenza
• Classificazione dei virus influenzali A
– Classificati sulla base di HA e NA
– sono noti finora negli animali 16 subtipi di HA e
9 subtipi di NA
– 3 subtipi di HA (1-3) e 2 di NA (1-2)
caratterizzano i virus umani “classici”
Natural hosts of influenza viruses
Haemagglutinin subtype
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
Neuraminidase subtype
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
Variabilità antigenica dei virus
influenzali
Varianti pandemiche: comparsa di nuovi tipi di
HA e NA sulla superficie
HA
virale (shift antigenico)
NA
- trasmissione all’uomo di
virus influenzali circolanti in
animali
Varianti epidemiche: mutazioni puntiformi nei
segmenti
genomici
codificanti le proteine di
superficie HA e NA (drift
antigenico)
- pressione immunologica
selettiva
Antigenic shift
Il verificarsi di un
antigenic shift è
irregolare,
relativamente
infrequente e non
prevedibile.
L’intera popolazione
risulta suscettibile =
PANDEMIA
Meccanismi responsabili dell’ antigenic shift
Sistemi di coltura virale
Tecniche di inoculazione nell’animale
Topino neonato:
• Inoculazione intracerebrale
• Inoculazione intraperitoneale
Tecniche di inoculazione nell’uovo
embrionato di pollo
1°
COLTURA D’ORGANO
Sono mantenute le relazioni intercellulari
Non infettate
Infettate
●Triturazione tessuto
● I frammenti vengono
sottoposti all’azione di agenti
chelanti (EDTA,) o enzimi
proteolitici (tripsina o
collagenasi) che degradano
la matrice del tessuto
COLTURE CELLULARI
Primarie: ottenute da cellule derivate da un tessuto
mediante disaggregazione enzimatica.
Le cellule si moltiplicano fino alla formazione di un monostrato
confluente
Coltura Primaria
●Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in
grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo
le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene
indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la
crescita)
Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le
attività biochimiche delle cellule in vivo
Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo
termine
Colture secondarie
Monostrato
confluente
• Coltura primaria
~ 200.000 cellule/ml in terreno al 10%SVF
• Coltura secondaria
Ciclo vitale di Cellule Primarie
Linea Cellulare Continua
●Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato
annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte
● Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di
colture primarie non tumorali
Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose
Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati
meno variabili delle colture primarie
Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare
Linee cellulari
Colture cellulari
Riconoscimento della moltiplicazione virale
 Metodi diretti:
o Effetti citopatici (ECP)
o Presenza di inclusioni
 Metodi indiretti:
o Emoadsorbimento
o Comparsa di potere emoagglutinante nel liquido di
coltura
o Presenza di antigeni virali (anticorpi marcati)
Citolisi
Rigonfiamento cellulare
Effetti citopatici
Sincizi
Effetto citopatico sinciziale
Corpi inclusi intracellulari
Si tratta di accumuli di particelle virali evidenziabili al
microscopio ottico.
La loro localizzazione cellulare è caratteristica per ciascun
virus (corpi inclusi da virus della rabbia e da virus del vaiolo
hanno localizzazione citoplasmatica, quelli da HSV, morbillo e
varicella nel nucleo).
CORPI INCLUSI DEL GUARNERI
Virus del vaiolo
EMOADSORBIMENTO
1. Aspirare il liquido di coltura
2. Aggiungere 2 ml di una sospensione
di eritrociti 0.08%
3. Refrigerare i tubi a 4°C per 30’
4. Osservare al microscopio
Titolazione dei virus
Metodi diretti
• Conta al microscopio elettronico
• Metodo delle placche di citolisi
Metodo delle placche
Titolazione del
virus mediante
conta delle
placche di
citolisi
Titolazione dei virus
Metodi indiretti
• Calcolo delle dosi infettanti 50%
• Titolo emoagglutinante
• Diametro delle lesioni prodotte in
vivo
• Dosaggio di antigeni virus-specifici
con metodiche immunologiche
• Dosaggio degli acidi nucleici virali
mediante PCR
Farmaci antivirali e ciclo replicativo virale
INIBITORI DEL DENUDAMENTO
Enfuvirtide
Zanamivir
Osaltamivir
Inibitori delle
proteasi