Transcript Biochimica_2_files/Tecniche di Biologia Molecolare (Dott. Bramanti).

DIPARTIMENTO DI SCIENZE CHIMICHE,
SEZ. BIOCHIMICA E E BIOLOGIA MOLECOLARE
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CATANIA
“ Alcune tecniche di Biologia molecolare
ed il loro apporto alle terapie tradizionali”
Vincenzo Bramanti
Catania, 01 Dicembre 2010
LA BIOLOGIA MOLECOLARE
è la scienza che, indubbiamente, ha esercitato il maggiore impatto sulla nostra
società negli ultimi 30 anni
L’espansione delle
tecniche e dei concetti
della biologia molecolare
Ha mutato
drasticamente
influenzato
la medicina
la farmacologia
i fondamenti delle
tradizionali scienze
umane.
ormoni ricombinanti
organismi transgenici
tessuti creati in vitro
alcuni esempi dei
prodotti e delle
tecniche derivati dalla
biologia molecolare
diagnosi
prenatali
xenotrapianti
nuovi trattamenti antitumorali
l’uso della reazione a catena della polimerasi (PCR)
nella scienza forense
Non è possibile parlare
dell'impatto rivoluzionario
delle biotecnologie sulla
terapia medica
Con il rilancio grazie agli
anticorpi monoclonali di
tecniche già consolidate come
Radio-Immuno Assay (RIA) e
Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay (ELISA),
senza ricordare il ruolo che la
diagnostica biotecnologica ha
giocato nel reimpostare la
medicina dell'ultimo decennio.
la diagnostica è andata
assumendo un ruolo di
primaria importanza in
medicina, già alla fine degli
anni settanta.
La specificità e la riproducibilità del
reagente monoclonale ha permesso, infatti,
di raggiungere traguardi di affidabilità e
precisione fino a allora inimmaginabili.
Verso la metà degli anni ottanta,
l’uso a scopo predittivo delle nuove
tecnologie del DNA ricombinante
ha dato vita alla diagnostica
molecolare.
Il legame della sonda alla
sequenza nucleotidica
complementare è altamente
specifico
Sonde costituite dà brevi
sequenze di acidi nucleici hanno
fatto cosi il loro “prepotente”
ingresso nella determinazione di
patologie infettive, neoplastiche
e genetiche.
ed il ripristino della
complementarietà originaria,
ovvero la formazione dell'ibrido,
avviene solo quando le paia di
basi sono esattamente
complementari.
Ma la rapida diffusione della
diagnostica molecolare avviene
soprattutto in seguito allo
sviluppo
reazione a
catena della
polimerasi o
PCR
Con questa tecnica si possono amplificare fino a un milione di
volte determinate sequenze di acidi nucleici rendendoli più
facilmente rilevabili all'ibridazione con sonde marcate.
Le ricadute della diagnostica biotecnologica sono di
grande importanza non solo nel campo della prevenzione,
ma anche in quello dello sviluppo delle terapie tradizionali.
verranno esaminati i vantaggi
che i nuovi prodotti
biotecnologici offrono alla
elaborazione di test diagnostici
affidabili e riproducibili.
Le principali metodologie utilizzate per
la diagnosi molecolare sono una
particolare applicazione di quanto già
detto
I test diagnostici aiutano a definire una situazione clinica e forniscono
informazioni che possono essere utilizzate per decidere la terapia da
intraprendere.
ELISA
Western Blot
Alcune tra le più comuni tecniche di
biologia molecolare utilizzate in
campo diagnostico-molecolare
sono
Southern Blot
Nothern Blot
l’immunocitochimica
PCR (polymerase chain reaction)
polimorfismi
Cenni ANTICORPI MONOCLONALI
Gli anticorpi monoclonali (mAb) costituiscono un insieme di anticorpi identici fra di essi
in quanto sono prodotti da linee cellulari provenienti da un solo tipo di cellula
immunitaria (quindi un clone cellulare). Dato un qualsiasi antigene, è possibile creare
uno o più anticorpi monoclonali in grado di legare specificamente un suo determinante
antigenico; questo implica la possibilità di individuare, neutralizzare o purificare la
sostanza in oggetto.
Questa importante caratteristica degli anticorpi monoclonali li rende uno strumento
estremamente efficace in biochimica, biologia molecolare, diagnostica e medicina.
Quando tali anticorpi vengono utilizzati in campo terapeutico, il nome dell'anticorpo
termina con il suffisso -mab.
Cenni ANTICORPI MONOCLONALI
Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico determinante antigenico (epitopo),
è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula
capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali
(monospecifici). Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo
brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo
termine di anticorpi.
La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e
la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose), utili per le loro
caratteristiche di maggior crescita e sopravvivenza. Molte delle risultanti cellule ibride (o
ibridomi), che vengono coltivate in vitro, manterranno l'immortalità, oltre a produrre
grandi quantità dell'anticorpo monospecifico.
Cenni ANTICORPI MONOCLONALI
La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale
immunizzato) e il mieloma di topo (l'animale più usato), viene ottenuta per
intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole.
Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto con il nome di
HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia dei mielomi che delle
cellule della milza non fuse, ma non dell’ibridoma che completa le due linee
parenterali.
Gli ibridomi vengono sottoposti a screening per la ricerca degli anticorpi specifici
cercati e quelli scelti vengono avviati alla conservazione o alla produzione in massa
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) è un tecnica per la quantificazione di
proteine che riesce a combinare la specificità di un anticorpo con la sensibilità di un
semplice saggio enzimatico, utilizzando anticorpi o antigeni coniugati con enzimi.
Il test ELISA, si basa sull'utilizzo di anticorpi marcati con un
enzima (generalmente la perossidassi), in modo che i coniugati
risultanti abbiano una attività sia immunologica sia enzimatica.
Essendo uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra, la reazione
antigene-anticorpo è immobilizzata e pertanto potrà facilmente essere evidenziata
con l'aggiunta del substrato, che reagendo con l'enzima produrrà una colorazione
osservabile a vista o quantificabile con un colorimetro.
ELISA
Esistono diversi KITS commerciali disponibili e quindi si possono
realizzare studi sierologici senza necessità di grandi mezzi.
Attualmente il test ELISA è uno dei metodi più
utilizzati per la diagnosi sierologica di diverse
malattie infettive
Il metodo ELISA è una tecnica
altamente sensibile e di grande
specificità.
Questa tecnica presenta, inoltre, una
buona riproducibilità e facilità
nell'interpretazione dei risultati.
ELISA
Esistono diversi modelli di
tecniche ELISA per la
determinazione
DETERMINAZIONE DI ANTIGENI
ANTIGENI
ANTICORPI
modello ELISA "Sandwich"
La modalità più frequente del metodo ELISA per la determinazione di antigeni è il
modello ELISA "Sandwich". In questo modo, la piastra è già predisposta con un
anticorpo fissato (monoclonale o policlonale) verso l'antigene campione, al quale si
aggiungerà un omogenato dell'organo sospetto, che in caso di reazione con l'anticorpo
della piastra, sarà messo in evidenza dopo l'aggiunta del secondo anticorpo marcato
con l'enzima. Per ultimo, si aggiunge il substrato per rilevare la reazione.
ELISA
Saggio diretto o a "sandwich".
Nel saggio diretto si ricerca la presenza
dell'antigene in un campione biologico. Può
essere, idealmente, schematizzato in tre fasi:
FASE A. Si fissa al substrato, che può essere PVC o nitrato di cellulosa, un anticorpo
monoclonale specifico per l'antigene che vogliamo ricercare. In commercio esistono dei kit
già "standardizzati" per la maggior parte degli scopi biologici inerenti al saggio ELISA.
FASE B. A questo punto si inserisce, in forma sierica, il campione biologico del quale
vogliamo verificare la presenza o meno dell'antigene che può essere, ad esempio, un virus.
Dopo un determinato arco di tempo se l'anticorpo ha trovato il suo epitopo specifico lo
lega a se formando il complesso anticorpo-antigene. Il sistema viene lavato
abbondantemente per evitare che tracce di antigene possono permanere all'interno.
FASE C. Nella fase C si provvede all'inserimento di un anticorpo monoclonale marcato. Gli
enzimi solitamente utilizzati per marcare un anticorpo sono la perossidasi o la fosfatasi
alcalina. Anche questa linea di anticorpi deve essere selettivamente specifica contro il
determinato antigene, per cui si necessita di anticorpi monoclonali. Per ultima cosa si
effettua il lavaggio che ha il compito di eliminare via dal sistema gli anticorpi marcati che
non si sono legati.
ELISA
Saggio diretto o a "sandwich".
Successivamente alle tre fasi si inserisce un liquido che, a contatto con l'enzima
perossidasi o con l'enzima fosfatasi alcalina, determina una variazione di colore
osservabile al microscopio o, nella maggior parte dei casi, ad occhio nudo. Se non c'è
antigene nel campione biologico questo non si lega e allontanato dal lavaggio per cui
nemmeno l'anticorpo marcato si lega senza produrre un dettaglio cromografico visibile.
ELISA
Saggio indiretto
A differenza del saggio a "sandwich" nel saggio
indiretto si valuta la presenza di un anticorpo
specifico all'antigene e il processo può essere
anch'esso schematizzato in tre fasi.
FASE A. La standardizzazione del saggio avviene agganciando il campione biologico al
substrato che può anche qui essere PVC o nitrato di cellulosa.
FASE B. Successivamente si inseriscono, in soluzione, un determinato quantitativo di
anticorpi monoclonali conosciuti per reagire contro l'antigene specifico di cui vogliamo
testare la presenza nel campione biologico. Si procede al lavaggio per eliminare gli eventuali
anticorpi che non hanno legato l'antigene. Se l'antigene non è specifico per l'anticorpo
allora nessun anticorpo inserito nella fase B potrò legarsi e, con il lavaggio, verra allontanato
dal sistema.
FASE C. La fase C prevede l'inserimento di un anticorpo marcato in soluzione. La marcatura
dell'anticorpo viene effettuata aggiungendo l'enzima perossidasi o fosfatasi alcalina
all'anticorpo che è specifico per gli anticorpi inseriti nella fase B. Gli anticorpi della fase C
sono chiamati, infatti, anticorpi anti-anticorpi.
ELISA
Saggio indiretto
Per ultimo procedimento si assiste all'inserimento di un liquido
che posto a contatto con l'enzima cambia di colore in modo del
tutto analogo per quanto succede nell' ELISA diretto.
Campo di utilizzo ELISA
VERSATILITÀ DEL
SAGGIO ELISA
apprezzata nel campo della ricerca
nel campo sanitario
Nel campo sanitario in particolar modo, è necessario produrre delle diagnosi precise ed
economiche. Esistono in commercio numerosi KIT i cui campi di azione si articolano su
diversi bersagli antigenici e, anche per questo, l' ELISA è un saggio di prima scelta nei
piccoli laboratori e nelle grandi strutture sanitarie.
Negli ospedali attrezzati a ricevere donazioni di sangue, difatti, si rende necessario conoscere
preventivamente se il paziente è portatore di malattie infettive e grazie alla velocità di
esecuzione dell' ELISA queste informazioni possono essere rilevate in poco tempo
LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
è un nuovo approccio all’esplorazione delle molecole fondamentali alla vita.
Il DNA ricombinante è caratterizzato dalla particolare azione di specifici
enzimi (Enzimi di Restrizione o endonucleasi) che agiscono sugli acidi nucleici.
Le endonucleasi riconoscono sequenze specifiche su DNA a doppia elica che
possono essere tagliate. I frammenti che ne derivano si possono separare e
individuare per mezzo di elettroforesi su gel. Frammenti contenenti particolari
sequenze possono essere identificate attraverso ibridizzazione con una sonda
marcata di DNA a singolo filamento (Southern blotting). Il DNA può essere
sequenziato per mezzo del taglio chimico al livello di basi particolari (metodo
Maxam-Gilbert) o per mezzo dell’interruzione controllata della replicazione
(metodo di Sanger).
LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
I frammenti derivati vengono separati per mezzo di elettroforesi su gel e
visualizzati per autoradiografia o per mezzo di marcature fluorescenti.
L’ibridizzazione con sonde specifiche di DNA complementare (cDNA) o di
RNA è utile per evidenziare specifiche sequenze.
Le sonde di DNA sono utilizzate anche per nuove combinazioni di DNA lunghe
un centinaio di nucleotidi, particolarmente importante è la PCR (reazione
polimerasica a catena) che rende possibile una grande amplificazione dei
segmenti specifici di DNA in vitro. Questa tecnica è molto importante per
identificare marcatori patogeni di cellule cancerose, per tipizzare genotipi
individuali e per leggere sequenze di DNA da fossili antichi milioni di anni.
Enzimi di restrizione e DNA ligasi

Sono chiamati anche ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE e sono particolari
tipi di enzima che riconoscono sequenze specifiche di DNA a doppia elica tagliando
entrambi i filamenti in punti specifici.

Caratteristica delle endonucleasi di restrizione è quella di riconoscere sequenze
palindromiche di lunghezza compresa tra le quattro e le otto basi idrolizzando un legame
fosfodiestere su ciascun filamento di questa regione.

Tali enzimi sono usati per tagliare molecole di DNA in frammenti specifici che
possono essere analizzati e manipolati. Sebbene le sequenze riconosciute siano alle volte
simili, ogni enzima è in grado di discriminarle con estrema precisione. In questa maniera è
possibile tagliare l’intero genoma umano in frammenti più maneggiabili, detti FRAMMENTI
DI RESTRIZIONE; o, conoscendone la sequenza, ritagliarne fuori un certo gene; o ancora,
modificare un gene accorciandolo; operazioni queste che preludono a qualunque studio di
biologia molecolare.
Enzimi di restrizione e DNA ligasi
La chiave che ha aperto le porte
alla tecnologia del DNA
ricombinante è stata
l'utilizzazione degli enzimi di
restrizione che tagliano il DNA a
livello di sequenze specifiche
popolazione di molecole
eterogenea per lunghezza
ma con estremità identiche
Prima della scoperta di questi enzimi era molto difficile operare sul DNA, si
utilizzava l’RNA o le proteine per studiare un determinato sito
Riuscendo ad operare con gli enzimi di restrizione e la PCR
(processo molto rapido che consente la replicazione in massa del
DNA) è stato notevolmente semplificato il processo di analisi
della molecola di DNA.
Ciò ha permesso una precisa identificazione delle porzioni di
DNA che regolano l’espressione di un determinato gene
Finora sono stati isolati molti enzimi di restrizione da diverse specie di batteri.
Ogni enzima taglia il DNA a livello di una precisa sequenza nucleotidica
La specificità e la varietà degli enzimi di restrizione hanno permesso ai
genetisti molecolari di identificare e isolare segmenti del DNA di molti
organismi, compreso l’uomo
Ci sono numerosi enzimi di restrizione in 861 tipi di batteri diversi, dal
punto di vista biochimico sono delle endo-desossi-ribonucleasi di
origine batterica che scindono un legame fosfodiesterico
QUESTI ENZIMI
Il DNA endogeno viene metilato (o modificato)
sui residui di adenina e citosina.
Gli enzimi di restrizione si possono suddividere in varie classi:

per specificità e sito di legame

per struttura proteica

per dipendenza da cofattori
CLASSE 1:
Sono complessi enzimatici multifunzionali che richiedono adenosin-metionina e Mg++, in quanto
senza la presenza di tali ioni l’enzima non funziona. Questi enzimi tagliano in siti aspecifici a valle
di circa 100-1000 paia di basi rispetto al punto che identificano come sito specifico
CLASSE 2:
Gli enzimi di questa classe vengono anche detti sito-specifici poiché idrolizzano in prossimità del
sito di legame. Infatti a differenza degli enzimi della classe 1, tagliano esattamente il DNA nel sito
riconosciuto. Anche questi complessi enzimatici necessitano degli ioni Mg++
CLASSE 3:
Sono complessi multienzimatici che tagliano in direzione 3’ a 25-27 paia di basi di distanza a
valle del sito riconosciuto. E’ necessaria anche in questa classe la presenza degli ioni Mg++
La seconda classe è
la più interessante
Tutti gli enzimi di restrizione operano
attraverso due processi di taglio dando
luogo a due tipi diversi di estremità
Sequenze palindromiche (4-8) che
presentano la stessa sequenza se
lette in direzione 5’-3’
Sticky end
Blant-end
Le estremità di tipo Stickers possono formare legami idrogeno con sequenze di basi
complementari quindi coesive e sono utilizzate per unire segmenti di codice genetico
idrolizzato con lo stesso enzima
Questa "adesività" permette di unire insieme frammenti di DNA non omologhi
inoltre, è possibile unire DNA provenienti da organismi diversi al fine di studiarli meglio
STICKY END
BLANT-END
Le estremità della tipologia Blant-end risultano invece piatte e quindi sono utilizzate per
unire due siti di DNA idrolizzati con due enzimi diversi
Tuttavia, molti enzimi di restrizione
generano frammenti con estremità
tronche non adesive
In condizioni appropriate un
particolare tipo di DNA-ligasi
(l’enzima che "incolla" le estremità)
può congiungere dei frammenti che
hanno questo tipo di estremità
L'ASSE DI SIMMETRIA NELLE SEQUENZE DI DNA
La maggior parte degli enzimi di restrizione si lega a sequenze specifiche diDNA
(siti di restrizione) che sono simmetrici attorno al loro punto mediano. La figura
mostra il sito di restrizione per l'enzima EcoRI sul DNA. L'asse di simmetria non
implica che quello sia il punto in cui l'enzima taglia l'asse.
Siti di taglio di restrizione
EcoRI
PstI
SmaI
Finora sono state caratterizzate oltre 2000 endonucleasi di restrizione
differenti, che vengono identificate con una sigla di tre lettere: la prima,
maiuscola, è la lettera iniziale del nome del Genere, e le altre due,
minuscole, sono le prime due lettere della stessa specie batterica. Ad
esempio, EcoR1 e HindIII sono endonucleasi di restrizione presenti
rispettivamente in particolari ceppi di E. coli e di Haemophilus influenzae.
esistono particolari condizioni che possono influire negativamente
sull’attività enzimatica che dipendono dà:
1.
PUREZZA DEL DNA ESTRATTO: un DNA impuro può alterare l’azione dell’enzima.
2.
TAMPONE: il tampone viene venduto insieme all’enzima specifico. Se si devono utilizzare
diversi tipi di enzimi la concentrazione salina del tampone deve essere compensata in maniera
adeguata.
3.
TEMPERATURA;
4.
METILAZIONE DEL DNA: se il DNA è metilato l’enzima non riconosce il sito.
5.
NUMERO DI PROTEINE LEGATE: se il DNA è avvolto in istoni l’enzima non riconosce il sito.
6.
VISCOSITA’ DEL DNA
7.
GLICEROLO: l’enzima per non rovinarsi è venduto in soluzione di glicerolo cosicché anche alla
temperatura di –20 °C non viene congelato. Possono nascere dei problemi quando la
concentrazione
di
glicerolo
supera
il
5%
poiché
l’enzima
viene
inibito.
8.
PH ED ETANOLO: sono altri due componenti che possono inibire l’enzima alterando il risultato
dell’esperimento.
9.
PUNTALI NUOVI: bisogna utilizzare puntali sempre sterili onde evitare la contaminazione
delle soluzioni. L’unità di misura dell’enzima è 1U, che è la quantità di enzima che taglia in un
ora a 37 °C 1 microgrammi di DNA campione
l’enzima
non
deve
essere
sottoposto
a
sbalzi
di
temperatura.
Cenni sulle sonde di ibridazione
 Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata ed avente una sequenza
complementare al DNA bersaglio che vogliamo individuare.
 Poiché la sonda e il DNA bersaglio sono complementari, possono appaiarsi ed
ibridare. Naturalmente sia il DNA blottato su filtro, che il DNA sonda devono essere
denaturati a filamenti singoli.
 Le condizioni di ibridizzazione prevedono condizioni severe - alte temperature
(65°C) e alta forza ionica, che permettono ibrididazioni solo tra molecole omologhe.
La posizione del frammento di restrizione bersaglio sulla membrana è quindi
identificata grazie al segnale del marcatore associato alla sonda.
Cenni sulle sonde di ibridazione
 Per effettuare l’ibridazione, la membrana viene messa, in genere, in un
contenitore di vetro con la sonda marcata e una soluzione tampone; il contenitore
viene fatto ruotare delicatamente per parecchie ore, in modo da permettere alla
sonda di ibridare con il DNA bersaglio.
 La membrana viene poi lavata per rimuovere la sonda in eccesso e il segnale della
sonda viene identificato.
SOUTHERN BLOT
Nella tecnica del ‘Southern blot’, così chiamata in onore del suo ideatore E.M. Southern,
gli ENZIMI DI RESTRIZIONE, permettono di dividere il DNA in maniera riproducibile: su ciò
si basa la possibilità di isolare il frammento di interesse, cioè quello che contiene una
specifica sequenza, che si realizza attraverso il Southern blot. I frammenti di restrizione di
un campione (quelli che si ottengono dopo l’incubazione del DNA con un enzima di
restrizione) sono separati per mezzo dell’elettroforesi; quindi il DNA viene denaturato e
trasferito dal gel a un substrato solido ( in genere un filtro di nitrocellulosa), in modo tale
da mantenere la posizione che avevano assunto nel gel.
SOUTHERN BLOT
Il filtro viene successivamente messo a contatto con una sonda specifica marcata
radioattivamente. La sonda si lega al filamento complementare e l’autoradiografia rivela
quindi la posizione dell’insieme ibridato (cioè del complesso frammento di restrizionesonda). I frammenti che ibridizzano con la sonda possono essere facilmente rilevati dalla
autoradiografia. In questo modo si può identificare un frammento particolare in mezzo a
milioni di altri frammenti.
La stessa procedura di analisi può essere seguita per individuare specifiche sequenze di
RNA. La tecnica di analisi dell’RNA è stata chiamata Northern blotting.
Northern blotting
La tecnica del Northern blotting è del tutto analoga a quella precedentente descritta del
Southern blotting, a parte la notevole differenza che si utilizza per identificare RNA.
Dal punto di vista tecnico i Northern blots sono più difficili per la considerevole propensione
dell’ RNA a degradarsi. Per evitarlo bisogna osservare molte precauzioni, lavorare in ambienti
ragionevolmente privi di RNasi ed utilizzare inibitori delle RNasi (Rnasine, DEPC, ecc.)
Contrariamente a quello che si potrebbe credere anche gli RNA vanno denaturati per
liberarli da strutture secondarie molto stabili. A questo scopo gli RNA vengono fatti
correre su gels di agarosio denaturanti ( per es. urea, formaldeide o gliossale)
Oltre al classico blotting per capillarità, per i Northern blotting si usano degli apparecchi
commerciali che trasferiscono l’RNA per aspirazione sotto vuoto in tampone alcalino.
RNA totale
Esempio di Northern blotting
elettroforesi
denaturante
trasferimento
alcalino su
ibridazione
con sonda
radioattiva
pesi
carta da filtro
membrana
gel
membrana
tampone di trasferimento
autoradiografia
Western blotting
La variante proteica del Southern blot prende il nome di Western blotting. A differenza
delle tecniche usate per gli acidi nucleici, nel Western blotting non si usa mai il
trasferimento per capillarità ma l’elettroblotting.
A differenza degli acidi nucleici, le proteine non hanno carica unitaria ma presentano
una enorme eterogeneità di carica. Questo problema viene generalmente risolto
separando le molecole proteiche in gel di acrilamide su SDS.
Western blotting
In questo modo oltre a sfruttare la grande capacità di risoluzione dell’acrilamide,
l’SDS, in congiunzione alla temperatura e ad agenti riducenti, denaturano tutte le
sub-unità proteiche in complessi micellari SDS-proteine che conferiscono loro
carica e massa approssimativamente unitaria.
In questo modo le proteine migreranno tutte, come gli acidi nucleici, verso il polo
positivo con velocità inversamente proporzionale al log10 del peso molecolare.
A differenza di altre tecniche di ibridazione il western blotting non fa ricorso a sonde di
acidi nucleici ma ad anticorpi diretti contro la/e proteina/e in analisi. L’anticorpo
primario viene quindi riconosciuto da un anticorpo secondario al quale viene coniugato
un cromoforo , di solito di natura enzimatica, che ne permette la rivelazione.
WESTERN BLOT
La tecnica del Western blot è una estensione
dell’elettroforesi su gel di poliacrilammide,
con cui si separano le molecole proteiche
presenti in un campione in base al loro PM.
È un tecnica che permette l’analisi sia
qualitativa che quantitativa delle proteine
presenti in un estratto cellulare, basandosi
sul riconoscimento di anticorpi specifici
diretti contro un dominio o una sequenza
segnale (tag) inserita nella proteina. Si
procede preparando un estratto proteico
dalle cellule. Da questa miscela viene
separata la proteina di interesse tramite
elettroforesi in gel SDS-PAGE.
STRUMENTAZIONE PER ELETTROFORESI
WESTERN BLOT
Separazione di Proteine
I campioni contenenti le proteine sono
miscelati con il tampone di carico (loading
buffer) e caricate sull’ SDS-PAGE gel
Le proteine attraverso l’elettroforesi sono
separate a seconda della loro dimensione
Western Blot Transfer
Le proteine separate sono trasferite dal gel su
una membrana (nitrocellulosa) con l’elettroblotting
Western blotting
1. Gel di poliacrilamide
in SDS
3. Elettroblotting
100V
- +
+
Spugna
Gel
Spugna
Membrana
2. Preparazione del “sandwich”
0,2A
WESTERN BLOT
Western Blot Detection
Dopo il trasferimento, I siti non specifici
vengono bloccati con un tampone (Blocking) che
contiene proteine (BSA, milk, Detector Block).
L’incubazione degli anticorpi primario e
secondario/coniugato seguono il blocco.
Dopo il lavaggio della membrana, il coniugato
viene riconosciuto aggiungendo il substrato
cromogenico e chemiluminescente
PM
(kDa)
94.0
67.0
43.0
30.0
Western Blot Risultati...
Le bande indicano la dimensione e la
presenza di specifiche proteine (linea per
linea), La dimensione è determinata dalla
comparazione di standard di peso molecolare.
20.1
14.4
A
B
PCR
Un importante passo in
avanti della biologia
molecolare
messa a punto di una tecnica nota
come PCR ovvero “reazione a catena
della polimerasi “.
permette la riproduzione in numerosissime copie di un
frammento specifico di DNA, in tempi più rapidi (la reazione
ha andamento esponenziale) e in modo più semplice di
quanto si riesce a fare con la clonazione
PCR
sfrutta alcune peculiarità della duplicazione del
DNA ad opera della DNA polimerasi
Le prestazioni (maggiore resa, minor tempo, minori costi) sono
migliorate con l’avvento delle DNA polimerasi termostabili (Taq
DNA polimerasi), isolate da batteri termofili, che hanno sostituito
la DNA polimerasi di E. coli
Può essere effettuata su DNA genomico o cDNA (DNA copia,
retrotrascritto da RNA)
PCR
LA DNA POLIMERASI , lega in sequenza, diversi nucleotidi in modo
da creare un filamento di DNA, usando come stampo un altro singolo
filamento dello stesso acido nucleico
1. Necessità di avere un DNAss (riscaldamento) come stampo per la
sintesi di un filamento complementare
2. Necessità di possedere un piccolo DNA innesco (primer) per
iniziare la sintesi, in corrispondenza del frammento che si vuole
amplificare
3. Sintesi del DNA solo in direzione 5’
3’.
4. Al termine di n cicli, il miscuglio di reazione contiene un numero
massimo teorico di molecole di DNA a doppia elica pari a 2n
Composizione tipica di una reazione di PCR:
• DNA contenente la sequenza da amplificare
• Due primers
• DNA polimerasi
• Miscela dei quattro nucleotidi precursori (dNTPs: 2’ desossinucleosidi 5’ trifosfato)
Riscaldamento
94°C, 5 min
STEP 1
Separazione
filamenti
Raffreddamento
30 – 65° C, 30 s
Appaiamento primers
(Annealing)
STEP 2
STEP 3
Sintesi DNA
72°, 5 min
Appaiamento primers
(Annealing)
Riscaldamento
94°C, 20 s
Sintesi DNA
72°C, 5 min
Separazione
filamenti
Filamenti
originari
Raffreddamento
30 – 65° C, 30 s
Filamenti estesi
all’estremo 3’
Ad ogni ciclo
il numero dei frammenti desiderati (quelli cioè posti tra i due
primers) si raddoppia (crescita esponenziale)
72°C, per 10 min
Vantaggi dell’uso della
Taq polimerasi
Per verificare il buon andamento
dell’amplificazione, in genere vengono
effettuate delle elettroforesi in gel di
agarosio
1.
L’enzima può essere aggiunto una sola volta all’inizio della reazione e
rimane attivo per 30-40 cicli di PCR.
2.
E’ così possibile automatizzare la PCR utilizzando apparecchi
termostatici ciclici.
3.
La Taq polimerasi aumenta la specificità e la sensibilità della PCR.
ELETTROFORESI ED ANALISI
DEI CAMPIONI DI DNA
•
OMOZIGOTE DOMINANTE se c'è una banda sola che corrisponde al controllo
(+/+), la persona è omozigote (+/+)
•
OMOZIGOTE RECESSIVO se c'è una banda sola che corrisponde al controllo (/-) la persona è omozigote
•
ETEROZIGOTE se ci sono due bande che corrispondono al controllo (+/-) la
persona è eterozigote (+/-)
•
BANDA ASSENTE: NON ESISTE LA SEQUENZA COMPLEMENTARE AI PRIMER
(il DNA non viene amplificato)
In base alla disposizione delle bande è possibile individuare il genotipo di un individuo
1 2
3
4 5
6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16
1.
La seconda banda di sinistra è quella di un OMOZIGOTE DOMINANTE cioè presenta segmenti di
DNA formati da 960 paia di basi (bp).
2.
La quarta banda è quella di un OMOZIGOTE RECESSIVO cioè presenta segmenti di DNA formati da
660 pb.
3.
La terza banda è quella di un ETEROZIGOTE cioè presenta segmenti di 960 pb e segmenti di 660
pb.Occorre notare però che la prima banda è costituita dai frammenti più corti rispetto alla
seconda. Infatti, in questo caso sono i frammenti di 660 pb ad essere amplificati di più durante la
PCR,
e
risultano
quindi
più
densi
del
segmento
più
lungo.
4.
Esiste un quarto caso (osservabile nella quinta colonna) in cui il DNA NON VIENE AMPLIFICATO
perchè non presenta le sequenze di bp riconosciute dai primer.
FATTORI CHE INFLUENZANO UNA PCR
Scelta dei primers
SPECIFICITA’
Condizioni di reazione
Contaminazioni
Eterogeneità
SENSIBILITA’
Presenza di inibitori
Efficienza della reazione
Standardizzazione della preparazione del campione
RIPRODUCIBILITA’
Standardizzazione del protocollo di PCR
Standardizzazione del metodo di rivelazione
ALCUNI UTILIZZI DELLA PCR A SCOPO DIAGNOSTICO

In medicina la PCR può offrire importanti informazioni diagnostiche, usando
primers specifici si può identificare la presenza di virus o di batteri

Si possono identificare mutazioni a carico di alcuni geni per il controllo della
crescita cellulare, può essere utilizzata inoltre per stabilire discendenze biologiche.

L’analisi di sangue e di campioni di spermatozoi attraverso la PCR può fornire
informazioni anche in casi di aggressioni e violenze carnali, inoltre tali metodica
permette di ricostruire il DNA da campioni antichi amplificandone i rari frammenti
sopravvissuti.
ALCUNI UTILIZZI DELLA PCR A SCOPO DIAGNOSTICO
 Diagnosi di Tubercolosi
mediante PCR
si estrae il DNA da una lesione e lo si amplifica con primers
specifici per un gene altamente conservato in tutte le specie
di Mycobacterium tubercolosis . Qualora c’è amplificazione, il
frammento viene ibridizzato con delle sonde speciespecifiche in modo da identificare il ceppo in questione.
 Diagnosi HIV mediante PCR
si utilizzano primers specifici per il DNA
virale. Se c’è amplificazione il soggetto è
infettato da HIV
 Diagnosi prenatale di emofilia
effettuata mediante PCR :
nel gene mutato viene perso il sito di BclI per cui l’azione
dell’enzima di restrizione non produce due frammenti (99 e 43
bp) ma rimane il frammento integro (142 bp).
 Determinazione del sesso
Per le malattie ereditarie legate all’X che colpiscono solo i
maschi. Es. nel cromosoma Y sono presenti delle sequenze
uniche (DYZ1 di 3,5 kb ripetuta 5000 volte) che possono essere
amplificate mediante PCR
IN CONCLUSIONE
L'impatto delle biotecnologie nella diagnostica si è innanzitutto avvertito nel sia di
origine virale che batterica.
Il continuo miglioramento dei saggi immunologici ha portato a livelli di grande precisione
la diagnostica infettivologica, che sta tuttavia attraversando una nuova grande
trasformazione grazie all'impiego delle sonde molecolari.
Un importante problema in cui la diagnostica biotecnologica può rivelarsi di estrema
importanza è quello della variabilità del genoma virale che ha tra le principali
conseguenze la generazione di mutanti di virus che sfuggono alla risposta immune e
danno luogo a infezioni croniche.
Di recente si è ipotizzato che la variabilità del virus sia alla base dell'ancora misteriosa
progressione dell'AIDS.
Anche la diagnosi prenatale delle malattie genetiche giocherà un ruolo fondamentale
nella medicina del secolo futuro.
Le prospettive per i prossimi anni sono veramente entusiasmanti, ma parecchi
problemi devono essere ancora risolti.
Molte delle mutazioni responsabili per le malattie genetiche sono veramente
infinitesime rispetto all'effetto drammatico che esse possono avere a livello
fenotipico: anche il cambio di una sola base in un gene può essere sufficiente per
eliminare l'espressione della proteina codificata da quel gene. D'altra parte la
variabilità a livello genetico tra individui diversi è un fatto comune, cosi come
cambiamenti a livello genico possono avvenire senza influenza sull'espressione
delle proteine.
La sfida della diagnostica
molecolare è dunque duplice
trovare la mutazione rara
nella sequenza genica
distinguere le mutazioni importanti
dal normale polimorfismo
A livello di laboratorio di ricerca l’abbinamento di diverse tecniche di biologia
molecolare rende anche possibile l'identificazione di piccoli difetti genici dovuti a
delezioni o inserzioni di una o di poche basi, ma il trasferimento a livello di test
clinico o di screening di popolazioni è ancora problematico e richiede ulteriori
sviluppi della tecnologia.
Concludendo, quindi, non vi sono dubbi nell'affermare che le biotecnologie
stanno cambiando radicalmente il modo in cui l’uomo combatte là malattia, cosi
come è altrettanto chiaro il fatto che i tempi con cui si acquisiscono nuove
conoscenze di importanza rivoluzionaria vadano sempre più accorciandosi grazie
a tecnologie fino a pochi anni fa inimmaginabili.
grazie per l’attenzione..
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
Il sequenziamento del DNA è la tecnica elettiva per
determinare la successione di basi (sequenza) di un
gene o di più tratti genici (fino all’intero genoma).
Le tappe prevedono:
• denaturazione del DNA
• ibridazione di un innesco (20 bp)
• allungamento dell’innesco ad opera
polimerasi (frammento di Klenow)
della
DNA
• terminazione della catena con 1 dideossinucleotide
(ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
SEQUENZIAMENTO DEL DNA (SANGER)
3’ 2’
SEQUENZIAMENTO DEL DNA (MAXAM-GILBERT)
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
(SANGER)
SEQUENZIAMENTO
DEL DNA (SANGER)
APPARECCHIATURE PER SEQUENZIAMENTO
CROMATOGRAMMA DI UNA SEQUENZA