Transcript Коррекция эндотелиальной дисфункции у крыс с

Волгоградский государственный медицинский университет
Коррекция эндотелиальной дисфункции у
крыс с экспериментальным сахарным
диабетом соединениями с
антиоксидантным действием
д.м.н., профессор Тюренков Иван
Николаевич
Патогенез эндотелиальной дисфункции при
сахарном диабете
Гиперинсулинемия
Оксидативный стресс
(ПОЛ, КПГ,
полиоловый путь
обмена глюкозы,
образование
пероксинитрита)
Гипергликемия
тромбогенных и
прокоагулянтных
факторов
факторов воспаления
(протеинкиназа С,Среактивный белок,
гомоцистеин, протеин С),
повышение проницаемости
сосудистой стенки
Эндотелиальная
дисфункция

Сахарный диабет
Смещение баланса
вазодилатациявазоконстрикция в
сторону последней
(снижение ЭЗВД)
Инсулинорезистентность
Нарушение в
системе синтеза,
выделения и
доступности NO
Нарушение липидного
баланса крови в
сторону атерогенных
липидов
Нейрогуморальная активация
(активация РААС, АТ II,
тканевого АПФ,
ремоделирование сосудистой
стенки, гипертрофия
кардиомиоцитов)
Материалы и методы исследования
Комплексный морфо-функциональный подход
в оценке эндотелиальной дисфункции:
• Изучение вазодилатирующей функции (ЭЗВД при введении
ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина;
мощности и стабильности NO-синтазной системы; индексы Пурселло и Гослинга)
• Изучение антитромботической функции (скорость образования
тромба (артериальный тромбоз); фактор фон Виллебранда)
• Изучение противоспалительной функции (уровень СРБ,
морфологические признаки воспаления эндотелия)
• Изучение антипролиферативной функции (пролиферация
сосудистой стенки, уровень циркулирующих эндотелиоцитов,
соотношение комплекса интима/медиа)
Флавицин (100 мг/кг)
Мексидол (100 мг/кг)
Эндотелиальная дисфункция на всех этапах исследования
моделировалась стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.
ЭСД вызывали введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг, в/в
Исходная скорость мозгового кровотока и
эластичность и сопротивление сосудистой стенки при ЭСД
Исходная скорость мозгового кровотока
30
25
Усл.ед.
20
**
15
10
**
Индекс
Гослинга
5
0
Интакт
ЭСД
Примечание - ЭСД – группа животных
с
экспериментальным
сахарным
диабетом без лечения; ** - достоверно по
отношению
к
группе
интактных
животных
(P≤0,01);
(Достоверность
оценивалась с помощью критерия
Манна-Уитни)
**
Индекс
Пурселло
ЭСД
Интакт
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Оценка вазодилатирующей функции эндотелия при
активации и блокаде синтеза эндогенного оксида азота у
животных с ЭСД
70
Прирост кровотока, %
60
**
50
40
30
**
20
10
0
-10
АЦХ
L-аргинин
НТГ
N-L-аргинин
**
-20
-30
-40
Интакт
ЭСД
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по
отношению к группе интактных животных (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Влияние флавицина и мексидола на исходную скорость мозгового кровотока
и эластичность и сопротивление сосудистой стенки при ЭСД
Исходная скорость мозгового
кровотока
30
25
Усл.ед.
20
**
15
10
5
0
Интакт
ЭСД
ЭСД+флавицин
ЭСД+мексидол
≠
Примечание - ЭСД – группа
животных с экспериментальным
сахарным диабетом без лечения; **
- достоверно по отношению к
группе
интактных
животных
(P≤0,01); ≠ - достоверно по
отношению к группе животных с
ЭСД
(P≤0,05);
(Достоверность
оценивалась с помощью критерия
Манна-Уитни)
≠
Индекс
Гослинга
**
ЭСД+мексидол
Индекс
Пурселло
≠
ЭСД+флавицин
**
ЭСД
Интакт
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Оценка вазодилатирующей функции эндотелия и эндотелиопротективного
действия флавицина и мексидола
при активации и блокаде синтеза эндогенного
оксида азота у животных с ЭСД
60
**
50
40
#
30
Прирост, %
20
##
##
##
**
10
0
-10
L-аргинин
АЦХ
НТГ
N-L-аргинин
**
-20
#
-30
Интакт
ЭСД
ЭСД+Флавицин
ЭСД+Мексидол
#
-40
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по
отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД
(P≤0,05); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью
критерия Манна-Уитни)
Изучение влияния мексидола и флавицина на стабильность и
мощность эндотелиальной NO-синтазной системы у животных с
ЭСД
35
Введение АЦХ
Прирост кровотока, %
30
##
25
##
##
##
##
20
##
15
**
10
**
5
**
0
Интакт
ЭСД
1-е введение
ЭСД+Флавицин
5-е введение
ЭСД+Мексидол
10-е введение
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по
отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01);
(Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Cкорость тромбообразования у интактной группы и
группы с ЭСД на модели артериального тромбоза
Скорость кровотока, усл.ед.
25
20
15
10
**
**
*
5
*
0
1мин
3мин
5мин
7мин
*
9мин
Интакт
*
11мин 13мин 15мин 17мин 19мин 21мин
ЭСД
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; * - достоверно по отношению к группе
интактных животных (P≤0,05); ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с
помощью критерия Манна-Уитни)
Влияние флавицина и мексидола на скорость
тромбообразования у животных с ЭСД на модели
артериального тромбоза
Скорость кровотока, усл.ед.
25
20
15
**
10
≠≠
≠≠
5
0
1
Мин.
2
3
4
Интакт
5
ЭСД
6
7
8
9
ЭСД+Флавицин
10
11
12
ЭСД+Мексидол
13
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; * - достоверно по отношению к группе
интактных животных (P≤0,05); ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе
животных с ЭСД (P≤0,05); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью
критерия Манна-Уитни)
Влияние флавицина и мексидола на уровень
фактора Виллебранда у животных с ЭСД
Уровень фактора Виллебранта
Интакт
ЭСД
**
ЭСД+Флавицин
#
ЭСД+Мексидол
%
#
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; **-достоверно по
отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД
(P≤0,05); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Изучение влияния флавицина и мексидола на уровень Среактивного белка при ЭСД
СРБ, мг/л
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
**
#
ол
Д+
М
ЭС
ла
ви
Д+
Ф
ЭС
ек
си
д
ци
н
Д
ЭС
Ин
т
ак
т
#
Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; **достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе
животных с ЭСД (P≤0,05); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Изучение влияния флавицина и мексидола на
морфологическое состояние эндотелия сосудов у
животных с ЭСД (головной мозг)
Интакт
Флавицин
ЭСД
Мексидол
Изучение влияния флавицина и мексидола на уровень
циркулирующих эндотелиоцитов при ЭСД
Уровень циркулирующих
эндотелиоцитов
**
14
ЦЭ/100 мкл
12
10
#
##
8
6
4
2
ек
+М
С
Д
А.
Э
Э
С
Д
+Ф
ла
си
до
л
ви
ци
н
С
Д
Э
И
нт
ак
т
0
Эндотелиальные клетки, фенотипически
верифицированные с применением
моноклональных атител к антигену CD34
А. - интактные животные
Б. – животные с ЭСД
Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным
диабетом без лечения; **-достоверно по отношению к группе интактных
животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД
(P≤0,05); ≠≠ достоверно по отношению к группе
животных с ЭСД
(P≤0,01);(Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Б.
Электронная микроскопия эндотелиоцитов
15
сосудов мозга крыс в норме, патологии и при применении
флавицина
Интакт
ЭСД
ЭСД+Флавицин
Примечание: овалами отмечены наиболее показательные эндотелиоциты
Общая схема развития апоптоза [Yu Q., Gao F., Xin L, 2011]
Морфометрическая оценка экспрессии 17эндотелина
и е-NOS у животных с ЭСД, получавших флавицин
и мексидол
Эндотелин (Clone RJT)
Эндотелиальная-NOS (Clone
RN5)
Оптическая плотность (единицы яркости)*
Интакт
35,9±3,5
86,3±3,2
ЭСД
79,2±3,6♦
34,4±2,7♦♦
ЭСД+Мексидол
50,2±1,9♪
62,8±3,1♪
ЭСД+Флавицин
45,7±4,4♪♪
74,4±2,4♪♪
(♦ - р<0,05; ♦♦ - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; ♪ - р<0,05; ♪- р<0,01 достоверно по отношению к группам
животных с ЭСД (критерий Уайта-Вилкоксона).
Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов по Allred D.C. et
18
al. (1998)
Интенсивность
экспрессии
Количество клеток
Интакт
ЭСД
Флавицин
Интакт
ЭСД
Флавицин
Каспаза
3
+
+++
+
+
+++
+
TRAIL
+
+++
++
+
++
+
NF-kB
+
+++
++
+
++
+
Индексы апоптоза и пролиферации эндотелиоцитов
Группы
Апоптотический индекс %
Интактная
3,6±0,2
ЭСД
36,2±2,9♦♦
Флавицин
19,25±1,9♪
(♦ - р<0,05; ♦♦ - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; ♪ - р<0,05; ♪- р<0,01
достоверно по отношению к группам животных с ЭСД (критерий Уайта-Вилкоксона).
Флавицин
Эндотелиопротекция
1) улучшение:
19
•вазодилатирующей
•антитромботической
•антипролиферативной
•противовоспалительной
функций эндотелия
2)снижение уровня маркеров
апоптоза:
•каспазы-3
•TRАIL
• NF-kB
3) увеличение активности eNOS
4) снижение экспрессии
эндотелина-1
Спасибо за внимание!