Transcript 1-Cultivo de Bacteriofagos

Cultivo y enumeración de
bacteriófagos
Dr. José A. Cardé-Serrano
Dr. Jesús Lee-Borges
Dra. Liza Jiménez
Dr. José M. Planas-Rivera
Universidad de Puerto Rico en Aguadilla
Objetivo
 Definir virus
 Explicar la morfología de un bacteriófago
 Conocer el ciclo de vida de un virus
 Realizar técnicas que permitan cultivar y
enumerar bacteriófagos
Definición virus
 El termino virus deriva del latín "veneno”
 Acido nucleico rodeado de una capa de
proteína
Introducción
 Este experimento demuestra la habilidad de los virus
de replicarse dentro de células susceptibles.
 Cultivo de virus
 Tipos de cultivo
 Una sola capa
 Cultivo primario – células vienen
directamente del organismo
 Cultivo secundario – células provienen de
linaje de células
 En suspensión
 Células no están en un medio sólido sino en
un medio liquido
Introducción

Método de detección
 Efectos citopatológicos
 Tabla 2.1 Página 29
 Ensayo de placas
 Fluorescencia
 Centros infecciosos
 Ensayo de transformación
 Páginas 27-33
Ciclo reproductivo de los virus
Entrada
 La entrada en la célula consta a su vez de dos
etapas:


la adsorción o fijación del virus en la superficie celular
penetración o paso a través de la membrana.
 Hay una alta especificidad en la fijación de un virus a
la membrana de su célula hospedadora.
 A lo largo de un proceso evolutivo, cada virus ha ido
adquiriendo sitios de unión específicos para anclarse
en la membrana de un determinado tipo celular.
Entrada…
 La penetración a través de la membrana sigue
diversas modalidades:


el virus completo,
solamente su ácido nucleico
 Por regla general, se necesita la participación de
muchas partículas virales para que alguno de ellos
logre penetrar en la célula

MOI – “Multiplicity of infection” – cuantas
partículas virales son necesarias para infectar una
célula
Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del
bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.
(a)el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola.
(b) Adhesión de las fibras de la cola.
(c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la
pared celular.
FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material
genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria.
(a)Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda se
encuentra extendida.
(b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra la
pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de
pared/membrana celular localizada directamente bajo la partícula viral.
http://www.hybridmedicalanimation.com/anim_bacterio
phage.html
Modalidades de penetración en la
célula
 Los virus complejos producen una rotura en la
membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje.
gracias a la presencia de algunas moléculas de enzimas
hidrolíticas entre las proteínas de la capsula.
 A través de la rotura, el tubo central inyecta el ADN
vírico, quedando la capsula vacía en el exterior de la
bacteria.
 La presencia de capsula en la superficie bacteriana es
un buen indicio de que la bacteria ha sufrido una
infección vírica.
Modalidades de penetración en la
célula
 Otros virus sin envoltura lipídica se introducen en la
célula con capsula y todo, lo cual puede realizarse de dos
maneras:
 Por penetración directa: después de la fijación, el virus
abre una brecha en la membrana y se introduce en el
citoplasma.

Por endocitosis: la membrana forma una invaginación
en torno al virus, llegando a formar una vesícula que
penetra en la célula. Formada la vesícula, el virus abre
una brecha en la membrana de la misma con ayuda de
algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta,
penetrando así en el citoplasma.
Modalidades de penetración en la
célula
 Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la
membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con
la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta
fusión de membranas puede realizarse en dos lugares
distintos:
Fusión en la superficie celular: de manera que el
virión penetra directamente en el citoplasma.
Fusión
con un lisosoma: se forma una vesícula por
endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la
partícula introducida; entonces, la cubierta lipídica del
virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión
escapa hacia el citoplasma.
“Uncoding” Integración
 La fase de integración corresponde a un tiempo, después
de la penetración, en que el virus parece desaparecer,
pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su
actividad.
 Lo que ocurre en esta fase es que se da un
desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha
penetrado completo), y su ácido nucleico queda asimilado
en las estructuras celulares aptas para los procesos de
replicación y transcripción.
 Esta fase, variable de unos tipos de virus a otros, termina
con la síntesis de los mARN necesarios para que se
sinteticen las proteínas que actuarán en la multiplicación
del virus.
Modalidades de fase de integración
 Ciclo ordinario o lítico: el ácido nucleico vírico procede
inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en
los mARN necesarios para su multiplicación, y prosigue
rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el más común en
la naturaleza.
 Ciclo lisogénico: fue descubierto por Lwoff en bacteriófagos.
El ADN vírico se cierra por sus extremos generando un ADN
circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar
específico en el que la secuencia de nucleótidos bacterianos es
semejante alguna región del ADN vírico.
Multiplicación
 La multiplicación del virus consiste tanto en
la replicación de su ácido nucleico, como en
la síntesis de las proteínas de la capsula.
 Los ácidos nucleicos y las proteínas recién
sintetizadas se ensamblan rápidamente,
produciéndose nuevas partículas víricas.
Liberación
 La liberación del virus consiste en la salida
de las nuevas partículas víricas (viriones),
que podrán infectar nuevas células iniciando
un nuevo ciclo.
Laboratorio: Parte Práctica
Medida de unidades infecciosas
 Se logra inoculando diluciones en serie de un
virus en un cultivo de células hospederas.
 La respuesta puede ser cuantitativa,

Ensayos en placas, transformación,
 Cualitativa

Todo o nada
Ensayo en placas
 PFU (Unidades de
formación de placas)
 Placa – Región clara en
el césped de bacterias


Infección lítica
Lisis de la bacteria
 PFU = # de placas x
factor de dilución

20- 100, 30 – 300
Materiales:
 Cinco tubos de agar suave de triptona
 Cinco platos de agar duro de triptona:
 Nueve tubos de caldo de triptona:
 Pipetas 1-ml
 Cultivo bacteriófago (M-13)
 Cultivo E. coli
Procedimiento
1. Rotule todos los tubos de dilución de la siguiente
manera:
- Cinco tubos de agar suave de triptona: 10-5, 10-6,
10-7, 10-8, 10-9
- Cinco platos de agar duro de triptona: 10-5, 10-6, 107, 10-8, 10-9
- Nueve tubos de caldo de triptona: 10-1-10-9
2. Coloque los cinco tubos del agar suave en un baño de
María ha 100°C para derretir el agar. Enfriar hasta
55°C y mantenerlo a esta temperatura hasta que lo vaya
usar.
3. Con pipetas de 1-ml, realice una dilución en serie (101-10-9) de la solución original del bacteriófago usando los
nueve tubos de 9-ml del caldo de triptona.
Procedimiento
4. Al tubo de agar suave marcado 10-5, añada dos
gotas del cultivo de E.coli y 0.1-ml del caldo de triptona
con una concentración de 10-4 del bacteriófago.
Mezcle, rotando el tubo de ensayo entre las palmas de
su mano.
5. Vierta el contenido del tubo sobre la placa marcada
10-5 antes de que el agar se endurezca. Mueva la
placa de manera gentil y uniformemente hasta que el
agar suave cubre por completo la placa. Deje que se
endurezca.
6. Repita el paso 4 para las soluciones de 10-5-10-9
del caldo de triptona.
7. Incube el plato con los cultivos por 24 horas a 37°C
Replication of M13 in E. coli
* Viral (+) strand DNA enters cytoplasm
* Complementary (-) strand is synthesized by bacterial enzymes
* DNA Gyrase, II topoisomerase, acts on double-stranded DNA and
catalyzes formation of negative supercoils in double-stranded DNA
* Final product is parental replicative form (RF) DNA
* A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF
* 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral strand
* pII circularizes displaced viral (+) strand DNA
* Pool of progeny double-stranded RF molecules produced
* Negative strand of RF is template of transcription
* mRNAs are translated into the phage proteins
Replication of M13 in E. coli
Phage proteins in the cytoplasm are pII, pX, and pV, and they are part of
the replication process of DNA. The other phage proteins are synthesized
and inserted into the cytoplasmic or outer membranes.
* pV dimers bind newly synthesized single-stranded DNA and prevent
conversion to RF DNA
* RF DNA synthesis continues and amount of pV reaches critical
concentration
* DNA replication switches to synthesis of single-stranded (+) viral DNA
* pV-DNA structures from about 800 nm long and 8 nm in diamter
* pV-DNA complex is substrate in phage assembly reaction
Assembly of phage is associated with the membrane of bacteria and
requires five capsid proteins, three assembly proteins, ATP, a proton
motive force, and at least one bacterial protein, thioredoxin.
¿Preguntas?
Diluciones:
-Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una
concentración de algo (el primero)…
- Se añade mas del segundo, y el efecto es reducir la
concentración del primero.
-Asi que si haces cálculos y ves que la concentración
aumenta!!... algo hicistes mal!
-Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración
disminuyó.
C1V1=C2V2
Diluciones….
C1V1=C2V2
Lo importante aquí es definir las variables bien.
Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas
10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua.
Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la
dilución?
Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables:
C1= concentración inicial, 0.2M
V1= volumen inicial, 10ml
C2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que
nos preguntan!
V2= volumen final, 100 ml.
Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen
final!!!
Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial
Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer
diluciones.
-Un factor de dilución es una expresión matemática que te
permite calcular cuanto mas diluído esta una solución resultante
preparada a partir de una solución “stock”.
-Se calcula como: el volumen final dividido entre el volumen
inicial. Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior?
100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10;
diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas
concentrado... factor de dilución es 10
Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial
Una vez tienes el factor de dilución que hacer?
•lo cambias a decimal o fraccion y lo multiplicas por la C1
•divides la C1 entre el fd.
C2=C1/fd;
•C2=0.2M/10=0.02M o C2=C1 x fd = 0.2M x 1/10
la [ ] será 1/10 de la original!
Diluciones Múltiples:
Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la
concentración final se calcula :
Fd1= 100ml/10ml = 10
Fd2 = 50ml/2ml = 25
Fd3 = 90ml/30ml= 3
FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…
Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva
concentracion:
Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM
Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1
PFU = 4 x(10X10X10x10x10) =
= 4 x (100,000) = 400,000
Diluciones Múltiples:
Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final
se calcula :
Fd1= 100ml/10ml = 10
Fd2 = 50ml/2ml = 25
Fd3 = 90ml/30ml= 3
FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces…
Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion:
Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM
Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1
PFU = 4 x(10X10X10x10x10) =
= 4 x (100,000) = 400,000