Transcript Szerves savak, PHA

Biotechnológia
Szerves savak: citromsav,
glükonsav, ecetsav
Polihidroxi-alkánsavak
Citromsav
• Élelmiszeripar
– 1910-ig főleg citromból
• 30-40 t citrom → 1 t citromsav = 3 ha
– James Currie: Aspergillus niger
• pH ≤ 2,5 → ≥ 60% konverzió
• Feltételek:
–
–
–
–
Alacsony pH
Alacsony [Mn2+]
Sok cukor
Alacsony növekedési sebesség
– 1930- világ citromsav termelés 90-95% gombával
• A. niger, Penicillium glaucum
Citromsav – Aspergillus niger
• Eukaryota
– Aerob glikolízis
– Citrát ciklus
• Fonalas gomba
– Fekete micélium
• Spóra
– Jól tárolható
– Tanninon szelektíven nevelhető
Citrát ciklus
• Cukorból acetil-CoA
• Acetil-CoA megy a
ciklusba
• Szent-Györgyi - Krebs
• Nem keletkezik ATP,
csak 2 CO2, 1 GTP és
8 e-
Citrát ciklus
Acetil-CoA
• Piruvát → Acetil-CoA lépés irreverzibilis
Kapcsolódás a sejtlégzéshez
8 energiadús elektron
a cukorból
elektronok O2-t redukálnak
proton gradienst hozva létre
proton gradiensből
ATP
Kapcsolódás a sejtlégzéshez
• Citrát kör + oxidatív foszforiláció adja az
eukarióta sejtek energiájának 95%-át
• A két folyamat számára külön
sejtszervecske alakult ki: mitokondrium
Kapcsolódás a sejtlégzéshez
Mátrix
Piruvát oxidatív dekarboxilezése
és citrát kör
(valamint zsírsav oxidáció)
Belső
mitokondrium
membrán
Külső
mitokondrium
membrán
Oxidatív foszforiláció
Átjárható
Citromsav biokémia
• Citrát ciklus csak a citromsavig megy el
alacsony pH-n.
Citromsav termelés
• Fémhiányos környezetben
– Alacsony pH a fém mobilizálásnak kedvez
– Citromsav kelátorként fém felvételt segíti
• Termeléshez a cukrot felveszi, citromsavat
kiválasztja, fém-citrátot felveszi
Citromsav termelés
• Általános feltételek
– Tápanyag
• Melasz
– Szukróz (glükóz-fruktóz diszacharid)
– Invertáz enzim monoszacharidokra bontja
• Keményítő hidrolizátum
– Maltóz (glükóz-glükóz diszacharid)
– Oxigén ellátás
• Felületi fermentáció agar tálcákon
Citromsav termelés
• Specifikus feltételek
– pH ≤ 2,5
– Fémion (Mn2+) koncentráció alacsony
• Kelátorok
– Na2-EDTA
– K4[Fe(CN)6] – hexaciano ferrát
– Kétfázisú fermentáció
• Micelium tenyésztés
• Lassú szaporodás mellett biokonverzió
Citromsav termelés
• Szilárd fázison fermentáció
Citromsav termelés
• Agar lemezbe
– Melasz
– K-hexaciano-ferrát
– Puffer mentes
• Levegő áramoltatás
– Vízgőzzel telített
Citromsav termelés
• Spórából indul
• Kétfázisú fermentáció
– biomassza
– termék
• Termelés végén citromsav
az agarban
Citromsav kinyerés
• Agarból vízzel kimossák
– Nagy térfogatban
– Citromsav + minden
vízoldékony
• Koncentrálás
– Ca(OH)2
– (Ca)3-citrát kicsapódik
– Szűrés
Citromsav kinyerés
• (Ca)3-citrát oldás
– H2SO4 – erős sav
– Citromsav + CaSO4
• Ioncserélő kromatográfia
• Kristályosítás
Citromsav felhasználás
• Ma: 700 000 tonna/év
– Élelmiszeripar
• tartósítószer
• üditő italok
• GRAS
– Kozmetikai ipar
– Kelátor
• Vízlágyító pl. Calgon
• fémtisztító
– Biopolimerek
• citrát-laktát polimerek
– Biofilterek
• pl. SO2 emisszió
Glükonsav
• Aspergillus niger
– Neutrális pH
– Fémion (Mn2+) kell
Glükonsav biokémia
• Aspergillus niger
– Glükóz oxidáz
• Extracelluláris enzim
• FAD-ot tartalmaz
• Redox folyamat
– Kataláz
• Kapcsolt reakció
• H2O2 védekezésre jó
• Lignin degradáció
Glükonsav biokémia
• Aspergillus niger
– Glükóz oxidáz
•
•
•
•
Extracelluláris enzim
FAD-ot tartalmaz
Redox folyamatok
pH=3 alatt inaktiválódik
Glükonsav termelés
• A. niger
– Általános feltételek
•
•
•
•
sok cukor
aerob
35-37 °C
alacsony P és/vagy S
– Specifikus feltételek
• pH> 5
• min. 10 mM Mn2+
– Extracelluláris reakció
• Termék az agarban
Glükonsav kinyerés
•
•
•
•
Oldás vízben
Ca(OH)2 kicsapás
H2SO4 leszorítás
Hagyományos tisztítás
– ld. Citromsav
Glükonsav felhasználás
• 60 000 tonna/év
– Tisztítószerek
• vízlágyítók
– Kelátoló szerek
• Nehézfém ionokat megköti
– Táp vagy élelmiszer adalék
• pl. tofu
– Bioszenzor
• Glükóz oxidáz
Ecetsav termelés
• Aerob – Acetobacter sp.
kevert ecetsav baktérium kultúra
• Alkohol oxidáció
– Alkohol dehidrogenáz
– Aldehid dehidrogenáz
• Oxigén limitált
– Immobilizálás pl. forgácson
– Biofilm = nagy felület
Ecetsav termelés
• Szubsztát és termékgátlás
– 10-15% alkoholból 10-15% ecetsav
– ≈ 100% konverziós hatásfok
– bor vs. tömény italok
• Félfolyamatos vagy kétlépéses eljárások
Ecetsav hatásfok növelés
• Immobilizálás bezárással
– pl. alginát, karrageán, porózus kerámia
– Gradiensek térben
Ecetsav
• Anaerob – Clostridium thermoaceticum
– glükóz → ecetsav
– Savstressz ellen pH kontroll
• pH ≈ 7,0
– 20-25% acetát koncentráció
– Ipari célra
Ecetsav kinyerés
• Élelmiszeripar
– 10-15% ecet
• Vegyipar
– Kombinált eljárások
Ecetsav felhasználás
• 200 000 tonna/év
– Élelmiszeripar
• Legrégebben használt tartósítószer
• Specialitás: kombucha
• Savanyított zöldségek
Ecetsav felhasználás
• Élelmiszeripar
• Legrégebben használt tartósítószer
• Specialitás: rizsecet
Ecetsav felhasználás
• Vegyipar
• Ca-Mg-acetát = “zöld só”
• -15 °C-ig használható
• Talajbaktériumok lebontják
• Nem korrodeál
Polihidroxi-alkánsavak
• 3-OH-vajsav
• OH-alkánsavak
• Prokarióta tartalék tápanyag
– Metanogének és tejsav baktériumok nem
termelik
– Ralstonia eutropha = Cupridavidus necator
• aerob, könnyen tenyészthető, toxint nem termel
Polihidroxi-alkánsavak
Polihidroxi-alkánsav: bioszintézis
• PHA szintáz
– CoA-aktivált hidroxi-alkánsav
– Konzervált –SH
– Láncnövekedés átészterezéssel
– Lánchossz fajtól függ
– Hidrofób polimer kicsapódik
• Ca-PHA granulum a sejtben
Polihidroxi-alkánsav: bioszintézis
Polihidroxi-alkánsav: indukció
• Táplálék felesleg
• Fontos elem limitáció
– P – nukleinsav szintézis
– S – fehérje szintézis
• Nem tud szaporodni
• Tartalék tápanyagot halmoz fel
Polihidroxi-alkánsav: in vivo
•
•
•
•
•
Tartalék tápanyag
Ozmotikusan inert a sejtben
Nem toxikus
Intracellulárisan jól megőrződik
Nitrogenázt védi 02 ellen
Polihidroxi-alkánsav: granulum
Polihidroxi-alkánsav: granulum
• Ca-só, vízben nem oldódik
– PHA
– PHA szintáz
– PHA depolimeráz
– Strukturális fehérjék
Polihidroxi-alkánsav: tulajdonságok
PHA
– termoplasztikus
– elasztoplasztikus
– vízben nem oldódik
– biokompatibilis
– biológiailag lebontható
– optikailag aktív
– piezoelektromos
Polihidroxi-alkánsav: termeltetés
• R. eutropha = Cupridavidus necator
(Zeneca)
• Két fázisú fermentálás
– biomassza szaporítás
– P vagy S limitált növekedés és sok
szénforrás mellett PHA termeltetés
• Kinyerés
– sejtfeltárás
– granulák elválasztása
• centrifugálás
• szűrés
– szerves oldószerrel extrakció
– spray drying
Polihidroxi-alkánsav: felhasználás
• Csomagolóanyag
– Flakon (Wella)
– Zacskó, tálca, folyadék
– Biológiailag lebomlik
Polihidroxi-alkánsav: felhasználás
• Prosztetikum, sebész cérna
• Kapszula, bioretard anyagok
– Lipáz, eszteráz bontja
Polihidroxi-alkánsav: felhasználás
• Prosztetikum, sebész cérna
• Kapszula, bioretard anyagok
– Lipáz, eszteráz bontja
Polihidroxi-alkánsav: lebontás
• Depolimeráz
– Hidrolizáló enzim
– Más észter kötést bontó
•
•
•
•
Eszteráz
Lipáz
Celluláz
Glükanáz
– Nem specifikus enzimek
• bioremediáció