Transcript Evapotranspirasi Potensial

DIAGRAM METODA KROMATOGRAFI
SAMPEL
KOLOM
f.g CAIR
Akiran
Grav
P
Size Excl
Chromt
DATAR
f.g GAS
dg TEK
f.g CAIR
GLC
PC Kr Kertas
P Med
P
flash
Chromt
* HPLC
TLC
Group Ion Excl HPCL
Basa Kuat CH2N(CH3)3,ClMed Basa N(CH3)3,ClBasa Lmh NH(R)2,ClAsam Kuat
SO3-,H+
Med Asam HPO3-,Na+
Excl Chromt  LC berdasar pemisahan/per
perbedaan dimensi molekul.
Contoh kompl camp protein dan estrogen 
BM beda, dpt dipisahkan dg
Chromatografi
KROMATOGRAFI
salah satu cara pemisahan dengan
dasar analisis menggunakan :
Dua Fasa
F. Tetap (Stationary)
F. Gerak (Mobile) ~ F. Cair
Pemisahan tergantung pada gerakan
relatif dua fasa tersebut.
Dari sifat-sifat kedua fasa 
Kromatografi dapat digolongkan :
Zat Padat = Kr. Serapan.
“ABS. CHROM”
Fasa Tetap
Zat Cair = Kr. Partisi.
“PARTITION CHROM”
Fasa Gerak
Zat Cair
Gas
Dari 4 macam bentuk fasa yang dapat
digunakan untuk an. Kromatografi 
Sistem Kromatografi dibedakan :
1. ƒG Cair ― ƒT Padat
Kr. Lapis Tipis = TLC
Krom Serapan
Kr. Penukar Ion
2. ƒG Gas ― ƒT Padat
Krom gas Padat = GC
3. ƒG Cair ― ƒT Cair
Krom Partisis  Krom Kertas
4. ƒG Gas ― ƒT Cair
 Krom. Gas Cair = GLC
 Krom. Kolom Kapiler
.
Semua pemisahan dg kromatografi tgt
pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa
yang dipisahkan, terdistribusi sendiri
diantara fasa-fasa gerak dan tetap dalam
perbandingan yang sangat berbeda-beda
satu sama lain.
KROMATOGRAFI SERAPAN
ƒT = Zat padat berfungsi sebagai adsorben
ƒG = Zat cair
Permukaan partikel padat biasanya lebih
aktif daripada bagian dalam. Yang pada
umumnya dikatakan mempunyai “aktivitas
permukaan” = “Survace Activity”.
Bila partikel dimasukkan dalam larutan 
permukaan partikel mempunyai daya tarik
baik terhadap zat larut atau pelarutnya.
Daya tarik / absorbsi dalam bentuk :




Elektrostastik (Ionik)
Daya tarik dua dipol
Antara dipol dan dipol induksi
Kekuatan Vander Waals
Partikel padat yang mempunyai
aktivitas permukaan dalam
kromatografi dinamakan “Adsorben”.
KESEIMBANGAN ADSORBSI
Bila larutan mengalir melalui permukaan aktif
terjadi proses adsorbsi dan desorbsi.
Hubungan antara konsentrasi zat yang ada
dalam larutan (CM) dan yang teradsorbsi (CS)
terlukis sebagai berikut :
Cm
A
Cs
Bentuk (A) bentuk konveks, terjadi karena
adanya variasi aktivitas dari permukaan yang
ada. Hubungan demikian sering dinamakan
“Freunddlich Isotherm” yang terjadi umumnya
pada sistem padat – cair.
B
Cm
Cs
Kurve isoterm garis lurus (B) merupakan
keadaan yang dikehendaki, permukaan ≠
akan menjadi jenuh dengan zat yang
diadsorbsi.
Kemiringan (slope) dari kurve isoterm garis
lurus merupakan koef distribusi dan ≠
tergantung besarnya konsentrasi.
C
Cm
Cs
Kurve isoterm bentuk konkaf (bentuk C)
dihasilkan dari reaksi yang terjadi
sedemikian sehingga menyebabkan
mempercepat proses adsorbsi secara
keseluruhan.
Ketiga macam perbedaan proses adsorbsi
menyebabkan terjadinya distorsi puncak
yang dihasilkan.
Respon
Konveks
Lurus
Konkaf
Puncak bentuk condong (Tailing) biasanya
diakibatkan adsorben terlalu aktif.
Hal ini dpt dikurangi  *) menutup sisi aktif
dengan zat lain *)menaikkan suhu, *) me(-)
banyaknya sampel yang akan dipisahkan.
ADSORBEN
Alumina dan silika gel. merupakan dua
adsorben yang paling populair penggunaannya.
Contoh : urutan absorben sesuai kemampuan
adsorbsi    
1.
2.
3.
4.
Alumina
Charcoal / Arang
Silika Gel
Magnesia
5.
6.
7.
8.
Kalium Karbonat
Sukrosa
Starch / Pati
Serbuk Selulosa
Aktivitas permukaan setiap adsorben berbeda.
Perlakuan pendahuluan menurut cara-cara
yang ditentukan dapat menghilangkan
perbedaan aktivitas tersebut.
Contoh :
Daya adsorbsi alumina,  dapat diatur
dengan mengatur kandungan  air.
Alumina ---- 3600C / 5 jam, ----- , dibiarkan
menyerap air sampai kadar tertentu yang
dinyatakan dalam skala “Brockmann”.
Alumina berkadar air 3% mempunyai
aktifitas yang umum digunakan.
Luas permukaan alumina 150 m2/g, kadar air
cukup 5% untuk pelapisannya.
Silika gel yang memp luas permukaan  500
m2/g tetapi mempunyai aktivitas kimia lebih
kecil, banyak digunakan untuk pemisahan
senyawa organik yang peka terhadap
perubahan-perubahan karena aktivitas
permukaan yang mempunyai sifat katalik.
Hubungan skala Brockmann dan
kadar air alumina
Skala Brockmann
I
II
III
IV
V
% Kadar Air
1
3
6
10
15
ZAT PELARUT
*) Zat pelarut mempunyai peranan penting
dalam Elusi yang dapat menentukan baikburuknya pemisahan.
*) Zat pelarut yang mampu menjalankan Elusi
terlalu cepat  ≠ akan mampu memisahkan
secara sempurna.
*) Elusi yang terlalu lambat  menyebabkan
waktu Retensi lama.
Sebaiknya zat pelarut ≠ tergantung dari
kekuatan elusinya. Kekuatan zat elusi : 
daya penyerapan pada penyerap (zat pengisi)
kolom.
Penyabab
Ke Polaran
Alumina
Silika Gel.
Kekuatan
Penyerap
Kekuatan penyerapan  dg me  polaritas zat
yang diserap.
Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deretan
pelarut dalam kolom dg silika gel,
 Air Murni  Metanol  Etanol  Propanol
 Aseton  Etil Asetat  Dietil Eter  Kloroform
 Metilenia Cl  Benzana  Toluena
 Trikloretilen  Karbon Tetra Cl  Sikloheksan
 Heksan.
Menurut Williams pelarut-pelarut dalam kolom
menggunakan “carbon aktif” untuk pemisahan
asam-asam amino dan sakarida dalam larutan
:
Adalah :
Etil Asetat , Dietil Eter , Propanol , Aseton ,
Etanol ,
Metanol , Air Murni .
Catatan pelarut harus betul-betul murni.
Pipet
Kertas Saring
Gambar Penanganan Cuplikan
PENGISIAN DAN CARA KERJA KOLOM
Pengisian kolom harus dikerjakan
dengan seragam. *) Penyeragaman
kepadatan dalam kolom dengan
vibrator atau planger,
*)atau adsorben dimasukkan ke dalam
kolom dalam bentuk bubur (Slurry) dan
partikelnya dibiarkan me.
Pengisian ≠seragam menimbulkan
rongga di tengah-tengah kolom.
Bagian dasar / bawah dan atas dari
isian kolom diberi glasswool atau
sintered glass disc untuk menyangga
isian.
Cad Zat Pelarut
Pelarut / f.grk
Kertas Saring
Kertas Saring// Pasir
Isian Kolom
Glass Wool
Penampung Eluat
Kecepatan elusi sebaiknya :*) konstant, dan
*)tgt dari :  ukuran partikel bhn isian kolom
 Dimensi kolom
 Viskositas cairan
 Tekanan untuk mengalirkan zat pelarut
PENANGANAN CUPLIKAN
Memasukkan cuplikan dari atas kolom
merupakan hal yang sangat penting
 Cuplikan harus rata
Dlm keadaan larutan yg sepekat
mungkin???
 Dicegah terjadinya 
Dicegah terjadinya penggoncangan
kolom
Untuk mendapatkan permukaan rata 
permukaan penyerap / bahan isian
diberi kertas saring atau pasir yang
bersih hingga membentuk lapisan tipis.
Pemasukan cuplikan melalui pipet
kecil – ujung pipet ditempelkan pada
dinding kolom. Selama zat cair lepas
dari pipet, ujung pipet digerakkan
berkeliling dalam kolom, dan
diupayakan ≠ menyentuh penyerap /
bahan isian.
Cuplikan yang tertinggal dalam
dinding kolom dicuci dengan cara
yang sama menggunakan pelarut
murni. Bila semua cuplikan telah
turun ke bagian bahan penyerap,
bahan pelarut / ƒG dapat dimasukkan
melalui corong pisah.
Kromatografi
Partisi
ƒG
Cair
ƒT
Cair
Dlm kromatografi ini fasa tetap /
stasioner ≠ berupa zat padat tetapi
cairan.
Fasa geraknya juga berupa cairan ~
HPLC “High Performance Liquid
Chromatography”.
= Liq-liq Partition Chromatogra phy
Zat yang dilarutkan akan terdistribusi
dg sendirinya diantara 2 fasa zat cair
Dan sesuai dengan koef partisinya.
Perbedaan koef partisi dari berbagai
komponen  campuran dapat
dipisahkan.
Keuntungan kromatografi partisi
dengan adsorbsi, karena :
- Daya ulangnya lebih baik
- Dari data kelarutan, hasil dapat
diramalkan
- Koef distribusi konstant dalam
jangka [ ] yang agak luas 
dapat menghasilkan puncak yang
simetris lebih tajam
Keunggulan “HPLC”
1.
Dapat menangani senyawa-2 yang stabilitas
terhadap suhu dan volatilitasnya terbatas,
bila tanpa menggunakan derivatisasi.
Contoh : analisis beberapa jenis gula, dg
HPLC tanpa derivatisasi
2. t pemisahan singkat  5 – 10 menit untuk
satu sampel.
3. Dapat digunakan untuk anal. Kuantitatif dg
presisi yang cukup tinggi.
4. Merup teknisi analisis yg peka,mempunyai
resolusi yang baik untuk pemisahan senyw
serupa.
Efisiensi maksimal dapat dicapai dg
*) mengatur kecepatan aliran fasa
gerak yang kecil, sehingga analisis
memakan waktu yang lama. Untuk
menanggulangi hal ini perlu
diperhatikan :
*) Me  P aliran ƒ gerak
*) Me(-)jarak tempuh zat yg dianalisis
*) dlm proses partisi,dg menggunakan
bahan isian atau penyangga
(Packing Material)
Bahan isian sebagai penyangga harus inert
thd senyawa-2 yang akan dipisahkan.
fT (stasr). Berupa cairan yang dilapiskan
pada permukaan bahan penyangga (Packing
Material).
Ikatan antara bahan penyangga dg ƒT , dapat
berupa ikatan fisik maupun kimiawi.
Dua tipe bahan isian yang ada dipasaran 
Pellicular Beads dan Microporous Prarticle.
 Pellicula Beads terdiri dari bagian dalam
yg padat, ≠ berpori, biasanya dari bahan
silika, kulit luar tipis bersifat porous, dg
ketebalan 1/30 – 1/40 dari  bagian dalam.
Besar partikel keseluruhan  40 .m.
Kelemahan tipe ini  luar permukaan dari
kulit yang berpori   1-25 m2/g  jarang
dipakai
 Microporous Particle / Mikropartikel
Ukuran antara 3-10 .m  memberikan luas
permukaan besar antara 200-300 m2/g
 Efisiensi tinggi karena  plat teoritis dapat
mencapai 10.000 dalam kolom sepanjang 25
cm.
Kromatografi partisi cair - cair  ƒT dan ƒG
harus ≠ bercampur.
Pelarut lebih polar digunakan sebagai ƒStat 
sistem dinamakan Krom Fase Normal.
Contoh :
Air sebagai ƒT yang melapisi silika gel
secara tipis. Air ter-ads. 50% dari berat
silika gel. kadang-2 dipakai sistem buffer.
Untuk menghasilkan tR yang diharapkan
jumlah fraksi terlarut dalam ƒG berkisar 0,05
– 0,5.
Bila ƒT dipakai senyawa non polar, dan ƒG
polar merupakan kebalikan fase normal.
“Reverse Phase Chromatography” untuk ini
penyangga padat yang non polar dapat
digunakan bubuk karet dengan lapis tipis
benzen sebagai ƒT dan air sebagai ƒG.
SUSUNAN PERALATAN
Pada HPLC dan GLC ≠ jauh berbeda.
Komponen utama :
 Reservoir pelarut untuk fase gerak
 Pompa untuk mengalirkan fase gerak
/ mobile dg kecepatan dan tekanan
tetap
 Injector untuk memasukkan sampel
Ada 2 macam   On Coloum
Injection / Langsung
 Holding Loop Injection / ≠ langsung
 Kolom
 Detector :  D. Ultraviolet
 D. Fluoresens
 D. Konduktivitas
 D. Indeks Refraksi
 D. FID. “Flame Ionitation
Detector”.
 Recorder
KOLOM KROMATOGRAFI
Dapat berupa pipa gelas dg kran dan gelas
penyaring di dalamnya.
Ukuran kolom dan efisiensi kolom dapat
dihitung secara teoritis.
Skema pemisahan dua campuran A danB
dengan kolom kromatografi
Solven
SAMPEL
A+B
B
A
Bahan
Pengisi
Kolom
B
A
B
Detektor
t0
t1
t2
t3
t4
Signal
A
B
t
t1
[ ]
A
B
t2
B
A
Jarak Migrasi 
KESEIMBANGAN DISTRIBUSI
Perbedaan migrasi merup hsl distribusi
keseimbangan dr senyawa A, B, C, …
diantara fTdan fG.
Distribusi molekul cuplikan antara dua
fasa dinyatakan dlm tetapan
keseimbangan dikenal sbg koef Distr
atau partisi = KD
1
CS
K
CM

A S
KD 
A M
CS = Kadar senyawa dlm fT (Diam), (fo)
CM = Kadar senyawa dlm fG (Mobil), (fa)
K, meliputi berbagai macam
mekanisme tgt sifat-2 fasa dan
interaksi cuplikan dengan setiap fasa.
Proses :
Penukaran ion
Serapan
Partisi
Harga K merupakan
populasi relatif
Senyawa dlm 2 fasa
k   populasi CS  CM 
Mol cuplikan akan tinggal
lebih lama di ƒSts = ƒo
Migrasi
BM
AM
Saat Seimbang 
BS  BM
AM  AS
BS
Kecepatan migrasi
ditentukan  mol
dalam fasa gerak
AS
Migrasi senyawa dipengaruhi
Sus Fasa Tetap
Suhu kolom
Sus Fasa Gerak
Sebagai dasar retensi
Keseimbangan dinamik
sebenarnya yang ada 
ΣMol dalam fasa gerak
Fraksi dalam fasa gerak 
ΣMol total
CM .VM
R
CM VM  C S VS
3
k'  k.VS / VM 
2
R
1
1  k.VS / VM
faktor kapasitas yang setara
dengan CS.VS / CM.VM
R
CM .VM

CM .VM  C S .VS
CM .VM 1
 C .V 
CM .VM 1  S S 
 CM .VM 
1
1


R
C S VS
VS
1
.
1  k.
C M VM
VM
k
ƒkapasitas
R
1
1  k'
VS
 k.
 k'
VM
harus selalu ≤ 1
1
R
1  k'
4
1
1 k'
Harus selalu ≤ 1, karena k’≥0, maka
kecepatan solut tidak pernah lebih besar
dari kecepatan ƒM
Ciri khas kedua pemisahan kromatografi 
penyebaran Mol yang menyebabkan
perbedaan puncak kromatogram.
 Molekul-molekul membentuk garis
sempit ~ luas puncak awal.
DIFUSI EDDY
A
1
3
2
4
6
5
8
Lebar
Awal
7
10
9
 Dalam waktu tertentu
B
1
6
5
8
3
2
9
 Perbedaan aliran F gerak
dalam kolom  molekul
cuplikan melewati jalan
berbeda, tergantung aliran
yang diikuti.
4
7
10
Lebar
Akhir
- Lorong alir , kecep. alir  
jarak yang ditempuh molekul
panjang.
- Lorong alir , kecep. alir  
jarak yang ditempuh mol
pendek.
 Perpindahan massa ƒG
berhubungan dg perbedaan
kecepatan alir setiap bagian
1
2
dari suatu lorong.
 ƒG berdekatan dg partikel,
5
akan bergerak lambat / ≠
Perpindahan
bergerak.
Massa ƒG
 ƒG ditengah aliran bergerak
lebih cepat  dlm rentang
waktu tertentu
~ molekul cuplikan dekat
partikel menempuh jarak
lebih pendek.
~ molekul cuplikan di tengah
aliran menempuh jarak
lebih panjang.
C
D
5
 Partikel fasa diam yang
berpori ƒG yang masuk dalam
pori ≠ bergerak.
 Molekul cuplikan bergerak
keluar masuk pori secara
Perpindahan Massa ƒG
difusi
yang berhenti
 Setelah molekul berdifusi
dalam pori dan terikat
dengan berbagai cara dalam
E
fasa tetap / diam 
- Bila molekul cuplikan
Perpindahan
terikat lama dalam ƒT
Massa ƒTETAP
karena difusi terlalu dlm
 menempuh jarak ke
bawah lebih pendek.
TEORI KELAJUAN / KECEPATAN
Dikembangkan oleh “Van Deemter” orang
Belanda 
Pers Van Deemter
B
HETP  A   C.μ
μ
5
H A
B
 C.μ
μ
Pers ini berguna untuk meningkat kan
peranan kolom kromatografi  efisiensi
kolom.
 diukur dengan :
Panjang Kolom cm
μ
.
Waktu Penahanan dtk 
A = Difusi Eddy / Dif. Olakan
B = Difusi Longitudinal
C = Transfer. Massa
 = Kecepatan aliran ƒG dlm kolom (cm/dtk)
Difusi Longitudinal
9
HETP
A
B
 Cμ
μ
Kur ve V.DT
6
Transfer
Massa
Hm in
B
μ
Teori
3
B

A
0
Cm
60
Opt
Dif. Eddy
C
A
140
cm/dtk
180
Hmin dan Opt diperoleh dari
turunan 1 Pers Van Deemter 
B
H  A   C.μ
μ
Opt
Opt
dH

0
d
B

C
dH
B
  2 C
d

B  C. 2
Hmin
6
B
B
B
A
. C C
C
B B
C C
A
B
B
B
.C.
 C.
B
C
C
Hmin
B
 A  2.C.
C
7
8
HETP  A  C.μ
LL.C
B  
t RA
A
t RB
B
tRC
C
t
tR
Signal
tm
W
o
t
Ciri Khas Kurve / Peak.
Kromatogram
• Setiap senyawa meninggalkan kolom
dalam bentuk simetri, sebagai kurve gaus
• Setiap puncak keluar dlm waktu tertentu,
yang dapat dipakai sebagai identifikasi
senyawa
tR = waktu retensi diukur mulai waktu
injeksi cuplikan  waktu puncak
maksimum meninggalkan kolom
• Perbedaan waktu retensi tR berdekatan.
Semakin besar ∆tR dari campuran semakin
mudah dipisahkan
RETENSI
Jika kecpt aliran ƒG dlm kolom μ cm/dtk
 kecepatan rata-rata cuplikan x = μx
μx tgt dari μ dan R (Fraksi Mol X dalam ƒG )
μx  μ.R
1
R
1  k'
μ
μx 
1  k'


1
μx  μ.
 ......(9)
1  K. Vs Vm 
Hub : μ , tR dan panjang kolom L.(cm)
L
tM 
μ
tR 
L
L
tR 
 μx 
tR
μx
μ.tM
L L  1 

 .

tR tM  1  k' 
μx
L
cm
tR  
 dtk  tR
μx cm dtk
tR = waktu retensi  waktu yang diperlukan
fraksi solut bermigrasi sepanjang lintasan
kolom
tR  tM tR'
(10).. tR  tM 1 k'   k' 

.....(11)
tM
tM
 Dapat terlihat dalam chromatografi
k’ = Faktor Kapasitas
tR
k' 

tM
Konsep teori plat dari persamaan
binomial
Retensi kadang-kadang diukur dengan
satuan Volume
VR  Vol total ƒG yang diperlukan untuk
mengelusi puncak senyawa x.
VR = tR x kecepatan alir ƒG melalui kolom
F = ml/dtk
VR = tR.F
Vol Total ƒG dalam kolom VM = tM.F
VR lebih disenangi dari tR karena tR
berubah dengan berubahnya kecep. alir
(F, μ), sedang VR tidak tergantung pada (F,
μ).
μ = cm/dtk
tR
VR  VM
tM
VR  VM 1  k' ......(12)
Konsep Teori Lempeng / Plat
Teori lempeng plat, perlu
untukmenerangkan proses terjadinya suatu
pemisahan secara kromatografi. Karena
proses yang terjadi pada kromatografi anlog
dengan proses ekstraksi bertingkat yang
dilakukan oleh Craig.
Dimana fasa diam dalam kromatografi
dianggap terdiri dari sejumlah ruang yang
mempunyai ukuran sama dan tiap ruang
mengandung sejumlah fasa mobil dan fasa
diam.
Dengan teori ekspansi binomial, distribusi
sampel dalam ruang dinyatakan dalam
rumus.
 K.VS

Vm


p  q  

 K.VS  Vm K.VS  Vm 
n
n
Distribusi sampel dlm ruang tersebut
merupakan fungsi dari koef distribusi (KD).
Perbandingan volume pelarut yang digunakan
(Vs / Vm) dan jumlah pemindahan atau transfer
(n).
Teori plat dapat menggambarkan kecepatan
migrasi secara kuantitatif tetapi tidak dapat
menerangkan bagaimana terjadinya pelebaran
pik. Sehingga teori tersebut dilengkapi
dengan teori kinetik / teori kecepatan.
sampel.
Fraksi waktu tinggal dalam fasa gerak, sbg
dasar RETENSI dinyatakan dlm pers 2, 3, 4
Fraksi waktu tinggal dalam fasa mobil sama
dengan jumlah molekul dalam fasa mobil
dibagi dengan jumlah total molekul dalam
sampel
Fraksi dlm fasa gerak (R)
Cm .Vm
.....(2)*
(R) =
Cm .Vm  Cs .Vs
k’ = K.Vs/Vm ….. (3)*
 faktor kapasitas setara
Cs.Vs/Cm.Vm

1
1  K.Vs Vm
R
1
....(4)*
1 k '
Besaran-besaran dlm kromatografi
WAKTU RETENSI
Apabila kecepatan alir fm (u, cm/dtk)
diatur tetap, t tetap, perbandingan fasa
diam dan fasa mobil tetap,  setiap
komponen dalam suatu sampel akan
mempunyai waktu tinggal yang tetap,
yaitu waktu yang diperlukan oleh suatu
komponen untuk melintasi suatu fasa
diam dengan panjang L.(cm)  waktu
retensi (tR)
Bila kecepatan rata-rata cuplikan x
= ux, maka ux akan tergantung dari
u dan R (fraksi mol x dalam fm)
u x  u.R
u
ux 
1  k'
1
R
1  k'
1
 u.
......(5)*
1  K. Vs Vm
Hubungan u dg tR dan panjang lintasan
L(cm) 
tm = waktu yang diperlukan oleh fasa mobil
itu sendiri (tanpa sampel) untuk keluar dari
fasa diam
L
panjg L
tm 
..tR 
 1 k'   tm 1 k' ....(6)*
u
kecpt u
tR  t m tR '
k' 

....(7)*
tm
tm
Konsep teori lempeng / plat
FAKTOR SELEKTIFITAS = 
Untuk pemisahan 2 zat terlarut A, B  melalui kolom
kromatografi  perlu diketahui faktor selektivitas A, B
(13).....α 
KB
KA
KB, KA adalah Koef Partisi A dan B
K'B
(14).....α 
K' A
Dalam eksperimen 
α
t'R )B
.....(16)
t'R ) A
k’ = Faktor Kapasitas
tR )B  tM
α
.....(15)
tR )A  tM
t’R t terkoreksi
RESOLUSI KOLOM = Rs
A
B
A
B
Rs = 0,75
0

Detektor
Signal
0
tRB
tRA
∆Z= ∆tR
A
tm
WA1/2
0
0
Rs = 1,0
WA/2
t
WA
B
Rs = 1,5
WB1/2
WB/2
WB
METODA LUAS PEAK ∆
Resolusi = perubahan nyata antara dua
spesies B, A dalam kolom
Dari grafik resolusi terbaca 3 bentuk
resolving power yang ≠ sama.
Rs = 1,5
Memisahkan A dan B secara
komplit, meskipun masih ada over lap 0,3%. ~
Resolusi Base Line
Rs = 1,0
Daerah peak B masih mengandung
A 4% - 2,5% dan sebaliknya
Rs = 0,75 A dan B belum sama sekali
terpisahkan
tR
2tR
Rs 

......(17)
1
1 WA  WB
WA .  WB .
2
2
2tR B  tR A 
Rs 
......(18)
WA  WB
1
Utk pemisahan yg baik R ≥ 1,5  ≥ 99,7%
Pemisahan spesies dlm kromatografi erat
hubungannya dengan faktor-faktor :
1. Efisiensi kolom 2. Efisiensi pelarut
Eff kolom diukur sbg ∑ plat teoritis = N,
Ketinggian ekivalen terhadap plat teoritis
= HETP
 HETP 
L
......(19)
N
(20)......N  L
H
L = Panjang Kolom
L  N.H.......(21)
dari pers. Gauss 
σ2
H
.....(22)
L
L2
N  2 ....(23)
σ
 stand deviasi pengamatan  Pers. Gauss
 = standard deviasi Peak Kromatografi
L

μ
tR
σ
σ
(24).....    
.....(25)
L
μ
tR
σ.tR

L
Daerah kurve Gauss maks, termasuk
diperhitungkan ± 2 standard deviasi ± 2 
Sehingga dalam perhitungan intersep kurve
maks diperhitungkan pula kira-kira ± 2 .
W = Lebar puncak yg diukur pada
perpotongan tangen dan garis dasar
 W  4.τ
L.W
σ
4.t
g
(27).....H 
L.W2
16.t 2
R
2
t
 R
 ....(28)
N  16
W


Catatan tR, W diukur dg satuan yang sama.
Cara lain untuk menghitung /
memperkirakan N  dg membandingkan
terhadap W ½ = Lebar ½ H.
W½
W
H
dasar ∆

 t
R
N  5,54
W
i/2








2
29
Hubungan Antara Rs dan Kolom
Hub matematis antara RS, kB, kA,  dan N.
Dengan asumsi WA ≈ W∆ ≈ W
Maka Pers
(18)
RS
2t R B  t R A 

WA  WB
 tRB  tR A


 RS ....(30)
 W

t R B  t R A  . N .....(31)
 tR 

R


S
W
tRB
4
 
2
Pers (28) N = 16
k 'B k 'A N
RS 
.
.....(32)
1  k 'B
4
k 'B
N α  1  k 'B 
 ......(33)
α
 RS 
.
.
k 'A
4
α  1  k 'B 
2
 α   1  k 'B 
N  16.RS 
.....(34)



 α  1   k 'B 
2
2
kA  kB
k 'A  k 'B  k ' α  1
N
 k' 
RS 
.α  1
 ......(35)
4
 1  k '
Eliminasi k’A dg
substitusi  = k’B/k’A
Rs 
2t R B  t R A 
......(18)
WA  WB
Bila diasumsikan WA = WB = W
2t R B  t R A  t R B  t R A
Rs 

2W
W
2 α 
N  16.RS 

α  1
2
 1  k'
 k'  .....(36)


2
 1 
μ  μ.

tRB
1

k
'


L
NH.1  k 'B 
N   t R B  
H
μ
μB 
L
(37).....t R B 
16RS .H  α 
.

μ
α 1
2
2
 1  k 'B 


 k 'B 2 
3
1/1
1/4
1/16
Rs = 0,6
Rs = 0,8
Rs = 1,25
Rs = 1,0
Gambar Pemisahan Sebagai Fungsi RS dan Kadar Relatif
Dari penjabaran rumus, diketahui bahwa untuk mengatur resolusi k’
dan N berpengaruh, sedang
k 2 kB
 untuk mengatur RS


k1 k A
dapat merubah : , N, k’
awal
k’
diubah
Plat
Teori
Faktor
Selektivit
as
N



T
Gambar Perubahan k’, N,  terhadap Resolusi
1
k' 

  1. N.

Dari rumus RS =
4
1

k
'


i

ii
iii
N
K’
Dari pers. RS terhadap , N, k’, ternyata faktor
(i), (ii), dan (iii) ≠ saling bergantung, dengan
demikian dapat dioptimalkan dulu faktor (i)
baru yang lain.
Selektivitas pemisahan ditunjukkan faktor 
yang berubah dengan mengatur susunan
ƒgerak dan ƒtetap.
 Me    pergeseran satu puncak relatif
terhadap lainnya.
 Waktu pemisahan dan tinggi dua puncak ≠
begitu berubah untuk perub  yang wajar.
Efisiensi pemisahan ditunjukkan faktor (ii) =
N, dengan mengubah L dan μ,
N suatu kolom di ,  menghasilkan
penyempitan dua puncak dan menaikkan
tinggi puncak. Waktu pemisahan ≠ langsung
dipengaruhi.
Faktor (iii), k’ berubah dengan mengubah
kekuatan fasa gerak. Perubahan k’ dapat
berpengaruh besar pada pemisahan.
k’  
perubahan jelek, tR pendek.
k’  
terjadi kenaikan nyata resolusi,
meskipun tinggi puncak turun cepat dan
waktu pemisahan naik.
Pengaruh ∑ Cuplikan
a

Kadar
Cuplikan
b
c
d
 Vol. Eluat
Dari gambar cuplikan kromatogram terlihat /
terbaca
a. Cuplikan sedikit,  Tinggi puncak naik
dg bertambahnya cuplikan
 tR ≠ dipengaruhi  RS tetap
b. Jumlah Cuplikan Kritik, - waktu retensi
menurun
c. d. Pe (+) cuplikan berlanjut,  Terjadi
penurunan nyata pada pemisahan dan tR.
Untuk pemisahan analitik, lebih baik bekerja
pada daerah dimana k’ tetap, yaitu ∑ cuplikan
harus kurang dari kapasitas linear kolom.
PUNCAK BEREKOR
Pada sistem Kromatografi yang baik,
setiap puncak merupakan kurve GAUSS
SIMETRI.
Puncak berekor kadang-kadang muncul
dalam kromatogram, dengan 4 bentuk
kemungkinan :
A
B
C
D
Bentuk A
Berekor Kimia
A
Terjadi karena ketidak
cocokan antara cuplikan
dengan ƒG atau ƒT.
Ditandai dengan lambat
kembali ekor puncak
pada garis dasar
 Pemisahan terhadap
puncak berikutnya jadi
jelek
 Jika terjadi puncak
berekor tipe ini, perlu
dicoba ƒG, ƒT yang lain
atau dicoba metoda lain
Bentuk B
Berekor Pelarut
B Akibat dari puncak
pelarut cuplikan
 Penggunaan cuplikan
sedikit mungkin, atau
menaikkan RS
Bentuk C
Poisson
C Terjadi karena kolom
kurang efisien, efisiensi
kolom .
 Jarang terjadi pada
kromatografi cairan
Bentuk D
Eksponansial
Normal
D Puncak sedikit kurang
simetri dan ini biasa
terjadi pada semua
kromatografi
KROMATOGRAFI PLANAR
Thin Layer Chrom “TLC”
Dua tipe
Kromatografi Planar
Paper Chromatography
Thin Layer Chromatography ≈ TLC ≈ KLT.
Teknik ini dikembangkan oleh “EGON STAHL”
dengan menghamparkan penyerap pada
lempeng gelas sehingga merupakan lapisan
tipis.
Kromatografi Serapan
KLT / TLC merup
Kromatografi Partisi
Karena absorben telah dilapisi air
dari udara
KLT cepat populair karena memberikan
banyak keuntungan :
-Peralatan sederhana
-Murah
-Waktu analisis cepat
-Daya pisah cukup baik
Sebagian besar teori kolom dapat diterapkan
pada KLT.
Pemisahan dilakukan oleh keseimbangan
berturutan cuplikan terhadap dua fasa, satu
diantaranya bergerak terhadap yang lain.
Derajat retensi pada KLT
dinyatakan sebagai :
Jarak yang ditempuhsenyawa terlarut
dR
 Rf 
dΜ
Jarak yang ditempuhpelarut
Jarak yg telah ditempuh pelarut dapat diukur
dengan mudah dan jarak tempuh cuplikan
diukur pada pusat kerapatan maksimum.
CS
Koef distribusik 
tetapberlaku
CM
Hubungan koefisien distribusi dengan Rƒ 
 m olsenyawaterlarut dalam f G
Rf 
 m oltetap senyawaterlarut dua fasa
CM .A M
Rf 
CM . A M  C S .A S
AM, AS = luas penampang melintang dua
fasa (tegak lurus lempeng)
AM
AM
Rf 

CS . A S AM  k . A S
AM 
CM
Luas penampang melintang sukar diukur 
persamaan di atas kurang praktis,
Rƒ merupakan bentuk modifikasi dari
tetapan keseimbangan.
Rƒ terbentuk dari:
*macam adsorben, *ketebalan,
*metoda arah pengembangan,
*kadar dan jumlah cuplikan, serta
*jarak yang ditempuh / noda.
Dengan melihat ketergantungan harga Rƒ
 akan lebih mudah dan tepat
menggunakan harga Rƒ relataif atau R
standard.
Dimana suatu senyawa standard di (+) ke
cuplikan.
Harga RSTD adalah angka banding jarak
tempuh dua bercak tersebut dalam
waktu pengembangan yang sama.
dM
Batas akhir pelarut
dg
2
W
1
WA
WB
Batas awal
Ditektor

Sinyal
A
B
 Jarak migrasi
 Gambar rekaman kromatografi
dengan densitometri scan
FAKTOR KAPASITAS
Persamaan-2 yang telah dijabarkan dapat
diadaptasi pada TLC.
tR, tM waktu yang dibutuhkan senyawa
bergerak dalam fasa ―~ dR
Bila μ kecepatan linier
tM
dR


tR
dM


dM  dR
dR
d
1 R
1 Rf
dM
k' 

dR
Rf
dM
k' 
Re solusi  R S
2dR A  dR B 
2Z
RS 

WA  WB
WA  WB
RS 
N    1  k ' 


 ....Pers(35)
4    1  k ' 
dM  dR B dR A
k 'B



k ' A dM  dR A dR B
faktor selektivitas
Semua prosedur kromatografi, kondisi
optimum untuk suatu pemisahan merupakan
kecocokan antara f tetap dan f gerak.
KLT / TLC fasa tetap berupa lapis tipis, pada
umumnya digunakan silika gel.
Untuk penggunaan dalam suatu tipe
pemisahan perbedaan fasa tetap terletak
pada :
 Struktur
 Pori-pori
 Struktur lubang
Silika gel perdagangan :
Ukuran 10 - 40μ  berpengaruh pada μ
dan pemisahan
 Ukuran 20 – 1500A
Berpengaruh pd
80 – 150 = pori besar
proses serapan
 Luas permukaan 300 – 1000m2/g
 Kelembaban relatif 45 – 75% mengikat air
7 – 20%
 Sangat higroskopis
 Deaktivasi ditentukan kelembaban relatif
kamar dan penyimpanan lempeng silika gel
 perlu diperhatikan
Macam-macam gel di perdagangan :
1. Silika gel dg pengikat
silika gel G dg pengikat - CaSO4 [5-15%]
silika gel S dg pengikat - pati
2. Silika gel dg pengikat dan indikator
flourisense
 Silika gel GF atau GF 24
Berflourisens kehijauan jika dilihat dg UV
 pendek.
Indikator yg digunakan timah-kadmium
sulfida atau mangan-timah silikat aktif.
3. Silika gel tanpa pengikat
Silika gel H atau silika gel N.
Lebih stabil dibanding bentuk I.
4. Silika gel tanpa pengikat dengan
indikator flourisense.
5. Silika gel untuk pemisahan preparatif.
Silika gel PF254 + 366
6. Alumina dengan pH 9, 7, 4
Dengan pengikat CuSO4
7. Selulosa, sebagai fasa diam KLT 
diperoleh mekanisme sama pada krom.
kertas
Selulosa untuk KLT ada 2 bentuk :
- serat asli
- Monokristal
Pemilihan fasa gerak pada KLT dengan
silika gel / alumina sebagai ft, mengikuti
aturan kromatografi serapan.
PELARUT SEMI MIKROSTOP (Menurut
kenaikan sifat Hidrofob) banyak digunakan.
 Kloroform biasanya distabilkan dengan Etanol
) Air
n. Anil Alkohol
Formanida
Etil Asetat
Metanol
Eter
Asam Asetat
n. Butil Asetat
Etanol
Kloroform
)) Benzena
Isopropanol
Aseton
Siklo Heksan
n. Propanol
Eter Petroleum
Tert-butanol
Petroleum
Fenol
m. Parafin
n. Butanol
) Untuk pemisahan senyawa Hidrofil
)) Untuk pemisahan senyawa Lipofil
METODOLOGI
1. Pembuata Lempeng Lapis Tipis
 Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan 20 x 20,
20 x 10, 20 x 5 cm
 Pencucian : - Air (+) deterjen Keringkan
- Aseton  keringkan
 Pelapisan : - 30 g bahan pelapis dibuat bubur
dengan air atau pelarut lain
- Pindahkan dengan segera dalam alat
perata.
- Ratakan bubur pada lempeng dengan
ketebalan 0,25mm
Untuk pemisahan preparatif tebal lapisan 0,5 – 2,0 mm.
 Pindahkan lempeng pada rak dengan hati-hati,
diamkan ± 30 menit
 ------- t 100 – 1200C ± 1 jam
 Simpan dalam Desikator
Perbandingan Bahan dan Pelarut untuk Lempeng
Bahan
Silika Gel
Silika Gel G / GF
Alumina
Alumina Oksida G
Selulosa MN 300
Selulosa MN 300 G
Poliamida
B : Air
1 : 1,5
1:2
1:1
1:2
1:5
1:6
1:9
(kloroform – metanol 2 : 3)
PENOTOLAN CUPLIKAN
 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20, 20 x 10, 20 x 5)
dengan tebal 0,2 mm.
Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat dengan diameter 3 – 6
mm, atau berupa garis; 1,5 – 2 cm dari tepi bawah.
Tepi bawah
Lempeng
KLT
Berupa
garis
 3 – 6 mm
1,5 – 2 cm
PENOTOLAN CUPLIKAN
 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20,
20 x 10, 20 x 5) ,dengan tebal 0,2 mm.
. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat
dg diameter 3 – 6 mm, atau berupa garis
1,5 – 2 cm dari tepi bawah.
Tepi bawah
Lempeng
KLT
Berupa
garis
 3 – 6 mm
1,5 – 2 cm
• Penotolan dengan mikro pipet atau
microsyringe diperlukan 1 – 20 μL.
Kelebihan bahan totolan
menyebabkan bercak asimetri
danperubahan harga Rƒ.
• HETP pada KLT biasanya 10 x 10, 10
x 20 cm. diperlukan cuplikan dalam
nano  pikogram setiap bercak.
Diameter bercak harus tidak lebih
1,0 – 1,5 mm dan vol cuplikan ± 0,2
μL.
PENGEMBANGAN KROMATOGRAM
Teknik naik linier (ascending)
Teknik turun / horisontal (descending)
Kromatogram biasanya dikembangkan
dlm bejana pengembang gelas atau
logam yg tertutup dan jenuh dengan
uap pelarut.
Teknik Perbaikan Pemisahan
• Pengembangan Berkelanjutan
ƒ gerak dialirkan pada bagian atas
lempeng pengembang. Teknik ini
digunakan untuk senyawa dengan Rƒ
0,05 – 0,2 setelah pengembangan
pertama.
Pengembangan Dua Dimensi
Cuplikan ditotolkan di salah satu
pojok kemudian dikembangkan
seperti biasa.
Kemudian diputar 900 sehingga pita
pemisahan I terletak pada bagian
bawah lempeng  dilakukan
pengembangan II sehingga terjadi
pemisahan berbeda pada arah
kedua.
Teknik ini berguna untuk cuplikan
yg mengandung banyak penyusun.
Pengembangan Serkuler
Fasa gerak dialirkan dengan sumbu
atau pompa melalui pipa kapiler
ditengah lapisan / tetap. Senyawa
terlarut bergerak dari tengah
penotolan menghasilkan lingkaranlingkaran sempit.
Pengembangan Beberapa Kali
Fasa gerak biasanya mudah
menguap, diuapkan setelah terjadi
pengembangan. Lempeng
dikembangkan lagi dengan ƒG yang
sama atau berbeda.
METODA IDENTIFIKASI
Untuk melihat senyawa ≠ berwarna
pada lempeng pengembang, biasanya
dilakukan metoda sebagai berikut :
1. Dengan UV (254 – 366 mm)
a. Pada lap berfluorisensi (S GF254)
bercak muncul sebagai bercak
hitam.
b. Senyawa berfluorisensi, pd lapisan
biasa bercak akan terlihat
berfluorisensi.
2. Disemprot pereaksi yg menghasilkan
warna atau berfluorisensi.
Digunakan utk deteksi asam sulfat,
(H2SO4 p., 50% H2SO4, 50% H2SO4 dlm
Metanol).
Reaksi ini terbentuk dlm keadaan dingin
atau dg --------100 -1200C
- ≠ dapat digunakan pada ft organik
atau sbg bahan pendukung “pati”
- Pereaksi lain yg banyak igunakan
uap iodium
Uap Pelarut
Cuplikan
A
B
Permukaan
Pelarut
C
Pelarut 2
D
Faktor yg mempengaruhi gerakan noda dlm KLT yang
juga berpengaruh terhadap Rƒ
1.
Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.
2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.
Aktivitas di  kan dg pemanasan dlm oven.
3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap.
4. Pelarut & [o kemurnian] f gerak.
- Kemurnian pelarut sangat penting
- Perbandingan campuran pelarut perlu
diperhatikan.
5. Derajat kejenuhan uap dalam bejana
pengembangan.
6. ∑ cuplikan yang digunakan
Tetesan cuplikan 
 Tendensi penyebaran noda
Kesalahan harga Rƒ  Terbentuknya ekor
 Efek kesetimbangan lain
7. Suhu, pemisahan sebaiknya pada suhu
tetap
Hal ini terutama untuk mencegah
perubahan-perubahan dalam komposisi
pelarut karena penguapan,( perubahan
fasa).
8. Kesetimbangan
Kesetimbangan dalam KLT lebih penting
dalam krom. kertas  perlu diupayakan
atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap
pelarut.
Gejala atm. bejana ≠ jenuh 
pengembangan dengan permukaan
pelarut cekung, fasa gerak bergerak
lebih berat di bagian tepi  .. harus
dihindarkan.
KROMATOGRAFI KERTAS
 Prinsip sama KLT, hanya fasa tetap digunakan kertas
bukan lempengan.
Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya
kapiler, dan menggerakkan komponen cuplikan. Pada
perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.
d pelarut
C
B
dC
dB
A
Awal
dA
Bila permukaan pelarut mulai bergerak
sampai waktu tetentu/ditetapkan, kertas
Diambil dan dikeringkan.
Kedudukan dari permukaan pelarut dibe
ri tanda.
Jika senyawa campuran berwarna akan
terlihat noda yang terpisah
Bila tdk berwarna perlu diteksi dg UV,di
Metoda identifikasi yg plg mudah dengan
Berdasar kedudukan noda relatif terhadap
Permukaan pelarut dg harga Rf
Rf 
Jarak perpindahan n noda komponen
Jarak gerak permukaan pelarut
Rf 
dP
d
 A
dA
dR
Karakteristik Kertas Kromatografi WHATMANN
Cepat
Sedang
Lambat
K. Tipis
No. 4
7
2
54
1
20
540
K. Tebal
No. 31
3
17
3 mm
-
Pelarut untuk kromatografi kertas
Pemisahan
Asam Amino
F, Cl, Br, I
Sebagai garam Na
Hg, Pb, Cd, Cu, Bi
Garam Clorida
Pelarut
Fenol / air
n. butanol / a. cuka / air
n. butanol / a. cuka / air
n. butanol / piridin / air
Piridin / air
Perbandingan
Larutan jenuh
4:1:5
12 : 3 : 5
1:1:1
90 : 10
n. butanol / 3M HCl
Larutan jenuh
BEBERAPA FAKTOR PENENTU Rƒ
1. Pelarut  pentingnya koefisien partisi
2. Suhu  perubahan suhu merubah koefisien
partisi dan kecepatan alir
3. Ukuran bejana  vol. bejana
mempengaruhi homogenitas atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan
komponen pelarut.
4. Kertas  sesuai jenis berpengaruh thd
keseimbangan partisi.
5. Sifat campuran.
APLIKASI DATA ANALISIS
1. Substan A dan B mempunyai waktu
retensi tRA = 16,40 tRB = 17,63 menit pada
kolom 30 cm. Lebar dasar puncak A = 1,11
dan B = 1,21 menit. Hitung :
a. RS resolusi kolom
b. N = ∑ rata-rata plate dalam kolom
c. H = tinggi plate orisinil
d. Panjang kolom untuk mencapai RS = 1,5
e. Berapa waktu yang dibutuhkan untuk
mengelusi B dari kolom (d)
f. Berapa tinggi plate dibutuhkan untuk RS =
1,5 pada kolom orisinil 30 cm dan waktu
orisinil
Penyelesaian :
a. Menggunaka n rumus R S
R S  2.

t
 2.
 tR A 
WA  WB
RB
17,63  16,40  1,06
1,11  1,21
 tR 
b. Persamaan N  16  
W 
2
2
16,40 
NA  16 
 3,493

 1,11 
2
 17,63 
NB  16 
 3,397

 1,21 
 3,493  3,397 
NAB  
 3,445

2


c. HETP  H  L N
H
d.
30
 8,7 cm
3,445
k’ dan  ≠ berubah dengan kenaikan N
ataupun L  substitusikan N1 dan N2
pada persamaan :
N
k' 

  1
RS 

4
1

k
'


R S1

R S2
N1

N2
R s  1,06
1,06

1,5
3,493
 1,06
3,397
N  3,445
R S harapan  1,5
2
3,445
 1,5 
 N2  3,445 
 6,9

N
1,06 
L  NH  6,9  8,7  60 cm
Elusi B dalam kolom () dengan RS =
1,5 membutuhkan waktu 35 menit.

tR1  R S 12
e. Dengan persamaan

tR 2  R S 22
16.R 2S .H    1  k'3
tR 


2

   1  k'
2
17,63 1,06 2

tR 2  1,5 2
tR 2  35 menit
f. Dari persamaan (e) H1 dan H2
disubstitusikan
tR1 R S12 H1

.
2
tR 2 R S 2 H2
tR 1  tR 2
R S12 .H1  R S 2 2 .H2
1,06 2 .8,7  1,5 2 .H2
2
 1,06 
 .8,7 H = H orisinil
H2  
1
 1,5 
H2 = H baru untuk
H  4,3 cm
mencapai RS = 1,5
dg L.tR.orisinil
2. KLT dipakai untuk memisahkan
campuran 3 carbamate insektisida
1) Carbofuran
2) Carbaryl
3
3) Metalkamate
2
Sampel 5 μL larutan mengandung 1
1
mg/mL setiap komponen dalam
CHCl3
Fasa gerak toluen / isoprophyl ether
70% / 30%. KLT 20 x 20 cm
 Cuplikan ditotolkan sebelah kanan
KLT
 Standard dari 3 komponen sebelah
kiri KLT
Dari pengamatan dengan ukuran cm
diperoleh data :
dM = 9,8
dR)1 = 1,7 W1 = 0,57
dR)2 = 2,5 W2 = 0,54 Hitung :
dR)3 = 3,9 W3 = 0,75 a. Rƒ untuk ketiga carbamate
b. Tinggi plate untuk setiap spot (noda)