Transcript une cellule infectée

Profil de Croissance Virale
Rendement de lyse
# de virus
Lyse
Latence
Éclipse
Temps
Infection
1
Rendement de Lyse
• Définition du rendement de lyse:
– No de virus générés par une cellule infectée suite à
un cycle infectieux complet
• Paramètres:
– La multiplicité d’infection (M.I.) est No de virus
infectieux disponible par cellule
– La M.I. sert aussi à déterminer le No de cellules
infectées
2
Multiplicité d’Infection
Nombre de virus = 4
M.I. = 4/6 = 0.67
Ou
4 sur 6 cellules seront infectées
Nombre de cellules = 6
•3
Multiplicité d’Infection
Nombre de virus = 10
M.I. = 10/6 = 1.6
Ou
6 sur 6 cellules seront infectées
Nombre de cellules = 6
4
Calcul de la M.I.
• 108 cellules sont exposées à 104 virus
– Quelle est la multiplicité d’infection?
• 104/108 = 10-4 Virus/cellule
• Combien de cellules seront infectées?
• 104 cellules seront infectées
• Combien de cellules restent non-infectés?
• 108-104 = approx. 108 cellules (et non 104)
5
Calcul du Rendement de Lyse
Nombre de virus produit =10
Ou
10 virus/4 cellules
Donc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule
Nombre de cellules infectées = 4
6
Calcul du Rendement de Lyse
• M.I.=0.0001; # de cellules = 108 ; Après 10
heures il y a 106 virus
– Quel est le rendement de lyse?
• 0.0001 virus/cellule x 108 cellules = 104 virus ensuite le
rendement de lyse est 106/104=100 virus/cellule
– Quelle est la multiplicité d’infection après le
premier cycle infectieux?
• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.0001 x 100
= 0.01.
7
Calcul du Rendement de Lyse (suite)
– Quelle est la multiplicité d’infection après le
deuxième cycle infectieux?
• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 =
1
– Quelle est No de cycle infectieux total?
• 3 cycles
– Combien de virus sont produit à la fin du dernier
cycle infectieux?
• Rendement x nombre total de cellule = 100 x 108
8
Énumération et Typage des Virus
• Compte direct
– Détermine nombre de virus totaux
• Essai de plages
– Détermine nombre de virus infectieux
• Essai d’hémagglutination
– Détermine nombre total de virus
– Possible seulement avec les virus hémagglutinant
• Qui possède l’hémmaglutinine – Ex. influenza
• Infectieux et non infectieux
• Essai d’inhibition d’hémagglutination
– Typage antigénique de virus hémagglutinants
9
Comptes Directs
• Coloration négative
• Microscopie électronique
• Ne distingue pas particules infectieuses de
non-infectieuses
• Utile pour les virus qui ne peuvent pas être
crus en laboratoire
• Utilise des billes à une concentration connue
pour estimer le volume du champ de vision
10
10
Comptes Directs Viraux
Ajouter billes
(104/mL)
Observer au microscope
10 billes dans un champ
Donc un champ = 1µL
21 virus dans un champ
Donc 21 virus/1µL = 2.1 X 104 virus/mL
11
Essai de Plages
• Infecter monocouches de cellules ou tapis
bactériens avec différentes dilutions de virus
• Déterminer le nombre de plages pour chaque
dilution
– Chaque plage est le résultat d’une seule cellule
infectée par une seule particule virale
• 1 UFP
12
Les Plages
• Effet cytopathique localisé
– Lyse cellulaire
• Chaque plage représente un foyer d’infection
– Chaque foyer d’infection est initié par une cellule
infectée
13
Préparation
virale
9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu
Facteur de
dilution
3.3 X
330
6
10
33
UFP/mL
3
33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4
Donc le titre de la suspension originale est:
14
Essai d’Hémagglutination
• Mesure de la quantité minimale de virus
requise pour agglutiner les globules rouges
– 1 unité d’hémagglutination (UHA)
Hémagglutination
partielle
Pas
d’hémagglutination
Hémagglutination
complète
≥1UHA
< 1UHA
0 UHA
15
Essai d’Hémagglutination
1:8
Titre = 32 UHA
1:2
virus
1:2
1:2
1:2
1:2
Dilution
8
Mélanger avec globules rouges
16
32
64
128
256
Vu de côté
Vu du haut
16
Essai d’Inhibition d’Hémagglutination
Anticorps anti-virus présentAnticorps anti-virus absent
Ac lie le virus
Liaison du virus au GR
inhibée
Hémagglutination inhibé
Virus lient GR
Hémagglutination
17
Points importants à connaître
Cours_08 Nov 2013
• Les cellules sanguines
–
–
–
–
Connaître les noms
Leur origine
Les fonctions
Lieu d’action
• Phagocytose (les différentes étapes)
• Les deux cascades du complément (en détail)
– Alterne
– MB-Lectine (MBL)
– Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades
– Comprendre comment les antigènes sont présentés
aux Lymphocytes
Cellules sanguines
Macrophage
Mastocyte
Éosinophile
Moelle
Érythrocytes
Basophile
Os
Monocyte
Cellule souche
hématopoïétique
Mégacaryocyte
Cellule
myeloïde Neutrophile
progénitrice
Plaquettes
Cellule progénitrice lymphoïde
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
19
Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes
• Cellules qui relâchent des granules
– Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse
inflammatoire
• Neutrophile
–
–
–
–
Cellule phagocytaire (cellules qui mangent)
Une concentration élevée indique d’une infection
Normalement ils restent dans système sanguin
Mais vont dans les tissus seulement s’il y a infection dans le tissu
• Éosinophile
– Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes)
– Combats les infections parasitiques
– Impliqué dans les réactions allergiques
• Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus)
– Initie et amplifie la réponse inflammatoire
20
Cellules sanguines
Macrophage
Mastocyte
Éosinophile
Moelle
Érythrocytes
Basophile
Os
Monocyte
Cellule souche
hématopoïétique
Mégacaryocyte
Cellule
myeloïde Neutrophile
progénitrice
Plaquettes
Cellule progénitrice lymphoïde
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
21
Leucocytes Non Granulaires
• Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique
– Cellules phagocytaires
– Relâchent les initiateurs de la réponse
inflammatoire
– Fait appel au système adaptatif (la 3ème ligne)
– Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ou
cellules professionnelles
• Molécule présentatrice - CMHII
• Cellules NK
– Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales22
Cellules sanguines
Macrophage
Mastocyte
Éosinophile
Moelle
Érythrocytes
Basophile
Os
Monocyte
Cellule souche
hématopoïétique
Mégacaryocyte
Cellule
myeloïde Neutrophile
progénitrice
Plaquettes
Cellule progénitrice lymphoïde
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
23
Processus de la Phagocytose
•Reconnaissance
•PRR (TLR) – PMAP
•Opsonines
•Ingestion
•Formation de phagosome
•Fusion avec lysosome
•Phagolysosome
•Digestion/Destruction
•Enzymatique & Chimique
•Expulsion
24
Phagocytose - Conséquences
• Digestion enzymatique
– Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases,
Nucléases
• Destruction oxydative par radicaux libres
• Superoxide dismutase : 2O2- + H2O à H2O2 + O2.
• Myéloperoxidase: Cl- + H2O2 à hypochlorite (javel)
• Relâchement d’initiateurs de la réponse
inflammatoire
• Synthèse et sécrétion de cytokines
• Présentation sur CMHII (CPA seulement)
25
Cellules NK
• Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules
sauf les neurones et les globules rouges
• Tue cellules qui n’ont pas ou peu de CMHI
– Cellules infectées par des virus
– Cellules cancéreuses
• Deux récepteurs de surface
• Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur
activateur)
– Interagit avec CMHI des cellules nucléées
• Récepteur activateur
– Interagis avec glycoprotéines induites par le stress
26
Action des Cellules NK
Récepteur inhibiteur
NK
Cellule
Survie
Récepteur activateur
NK
Cellule
Infectée
CMHI
Cellule
Protéine activatrice
Cellule
Infectée
27
Cascades du Complément
• La réponse innée comporte deux cascades
– Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand):
• Implique une collection de protéines sériques (libre
dans le serum et inactives)
– Protéines du complément:
• C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9
– Protéines accessoires: B et P
– Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez
les bactérie (Voie MBL)
– Protéases: MASP-1 et MASP-2
• Initié par la liaison à des composantes communes à
une grande variété de bactéries:
– Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque
– MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules
28
Voie Alterne
C3
C3 C5
+ H 2O
C3a + C3b
C5a
C3b
C3a
Ba
C3 C5
Convertase
Convertase
C3b BbB
P
C3b
+
C5b
Complexe CAM
C5b C6 C7 C8
Bactérie Gram Négative
CC C
C9C 9 9CC
99 C 99
9
•29
29
Voie de la MB-Lectine
C5a
C4aC2b
C2a
C5
+
C5b
MASP1
C4b
MBL
C4b
C3b
C3 C3a
C2a
C5b C6 C7 C8
Capsule Bactérienne
CC C
C
C9
9
C9
C
C
99 99
9
30
30
Conséquences des Voies du Complément
• Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes
doivent être détruits)
– Liaison de C3b et C4b sur la bactérie
• Bactéries, virus et parasites
• Anaphylatoxines (des alarmes)
– C3a et C5a
• Activent granulocytes et monocytes
– Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire
– Dégranulation
– Recrutement des autres cellules dans la région
• CAM (pore)
– Lyse osmotique
• Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme d’atteindre
la paroi
31
• Parasites – Perte de solutés
Présentation & Activation
• La présentation par les CPA est faite
seulement aux lymphocytes Ta
• Reconnaissance par les paratopes des RCT
appropriés des lymphocytes Ta
– Les CPA sécrètent des cytokines activatrices
(substances solubles que agissent sur d’autres
cellules)
– Amplification clonale des Ta qui sont sélectionnées
– Donc la réponse acquise est initiée!
32
Lymphocytes TA
• Récepteur cellulaire – RCT
– Reconnaissance d’épitopes non-soi
présenté par le CMHII
• Modes d’action: Sécrétion de cytokines pour
– Activer d’autres lymphocytes (Tc, B) et les CPA
(Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique)
RCT
TA
CD4
33
Lymphocytes TA
• Un Lymphocyte TA possède des RCT avec un
paratope capable de reconnaître un épitope
associé au CMHII
– Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute
sa vie
– Elle ne pourra pas reconnaitre d’autres épitopes
• Pour reconnaître un autre épitope on a besoin
d’un autre lymphocyte TA avec un paratope
spécifique pour ce nouvel epitope
– C’est la raison pour laquelle on a un répertoire élevé
34
Présentation aux Cellules TA
CMHII
TA
TA
CD4
CD4
CPA
RCT
Paratope
TA
CD4
Amplification clonale
TA
CD4
TA
CD4
TA
CD4
35
3e Ligne-Le Système Adaptatif
• Caractéristiques:
– Spécifique
– Acquiert une mémoire après une première rencontre
– Capable d’apprendre et de s’améliorer suite à des
infections subséquentes
– Contrairement ou système innée il fait la
discrimination entre le “soi” et le “non-soi”
36
Deux Fronts
Extracellulaire
Intracellulaire
• Réponse Humorale
• Antigènes exogènes:
• Réponse Cellulaire
• Antigènes endogènes:
–
–
–
–
–
Bactéries
Virus
Mycètes
Parasites
Toxines
– Quelques bactéries
• Ex. Mycoplasmes
• Mycobactérium
– Virus
37
Participants Cellulaires
• CPA
– Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules
dendritiques
• Lymphocytes Ta (T auxiliaire)
– TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène)
– TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène)
• Lymphocytes B
– Réponse Humorale (contre antigène exogène)
• Lymphocytes Tc
– Réponse cellulaire (contre antigène endogène)
38
La Réponse Humorale
1. Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un
épitope de l’antigène
–
C’est la sélection clonale
2. Si l’antigène se lie à la RCB, l’endocytose du complexe
RCB-Ag se fait
3. Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag
4. Présentation d’épitopes complexés sur le CMHII à des
cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées
–
Donc c’est la deuxième fois que la TH2 se fait présenter l’Ag
5. La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B
6. Ensuite l’activation du lymphocyte B fait l’amplification
clonale et se différence en plasmocytes et cellule B
mémoire
39
Lymphocytes B
• Un Lymphocyte B possède un RCB capable de
reconnaître un épitope avec un paratope
• Le RCB est formé de 2 isotypes d’anticorps
– IgM & IgD membranaire
• C’est une molécule présentatrice
– Donc elle possède un CMHII
• Les lymphocytes B secrètent aussi
des molécules effectrices (Anticorps)
– 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE
RCB
IgM & IgD membranaire
40
La Réponse Humorale
• Les plasmocytes secrètent des anticorps
– Une cellule peu seulement produire des
anticorps avec un paratope (le même paratope
que la cellule mère)
– Elle ne peut pas changer le paratope ni l’épitope
qu’il reconnait
• Les cellules B mémoire gardent une mémoire
pour l’épitope
– Cela fait aussi que la représentation de cette
cellule est plus grande
– Donc la prochaine réponse est plus rapide
41
Répertoire de lymphocytes B Naïf
La Réponse Humorale
Épitopes
CMHII
RCB: IgM ou IgD
Cytokines
Activation
Antigène
Amplification clonale et différentiation
M
P
M
B Mémoires
P
P
Sécrétion d’Ac
P
Plasmocytes
42
Les Anticorps (Immunoglobulines)
Sites de liaisons d’épitopes antigéniques
Chaîne lourde
2 X Fab
Région variable
Région constante
Liens disulfures
Chaîne légère
Région variable
Région constante
Isotype
1 X Fc
Idiotype
43
Les Anticorps (Immunoglobulines)
• Fab (Fragment Antigen Binding)
– Région responsable de la reconnaissance de
l’épitope
– N’est pas responsable de la fonction
• Fc (Fragment constant)
– Région responsable de la fonction
– N’est pas implique dans le reconnaissance
44
Immunoglobulines - Cinq Isotypes
• IgD
• IgM
• IgG
• IgA
Déterminé par la région Constante
Confère fonctionnalité
• IgE
• Les cellules B peuvent produire 5 isotypes (Le mode
d’action des Ac est déterminé par l’isotype)
• Mais seulement 1 idiotype (resposable de la
reconnaissance de l’epitope)
45
IgD
• Monomère valence de 2
– Peut reconnaitre 2 molecules
d’un même epitopes
• Ac exclusivement membranaire
– Pas secrété
• Ac de surface des cellules B
• Represente le RCB
46
IgM
• Pentamère (valence de 10)
• Anticorps de surface
• RCB
– Forme membranaire mais peut
être secrété
• Premier Ac sécrété
• Fixation du complément
• Agglutinant
• Agit comme étiquette (ADCC)
reconnue par cellules NK
47
IgG
• Monomère (valence de 2)
• Ac sérique prédominant
– Plus abondant dans le sérum
• Le seul que peut traverser le placenta
– Donc peu protéger le fétus
• Fait la fixation du complément
• Région Fc est une opsonine
– Reconnue par phagocytes
• Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules
NK
48
IgA
• Dimère (valence de 4)
• Principalement associé aux muqueuses
– Dans les orifices (la bouche, le nez, l’anus, etc..)
• Neutralisant et agglutinant
49
IgE
• Monomère
– Secrété par les lymphocyte B
• Leurs régions Fc se lient aux membranes des
macrophages, basophiles et mastocytes
– Deviennent donc des Ac membranaires
• Impliqué dans les réactions allergiques
– Ces cellules du système innée acquièrent
des récepteurs qui les rendent spécifiques
50
Modes d’Actions des Anticorps
• Agglutination
IgM et IgA
• Neutralisation
IgM, IgA et IgG
• Opsonisation
IgG et IgM
• ADCC
IgG et IgM
• Dégranulation des macrophages
IgE
• Fixation du complément
IgM et IgG
– Voie classique du complément
51
Agglutination
• Favorise la phagocytose
• Inactive l’envahisseur
52
Neutralisation
• Liaison à des composantes essentielles causant
l’inactivation
53
Opsonisation par IgG ou IgM
• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont des opsonines
reconnues par les cellules phagocytaire
– Le lysozyme tue toute les cellules dans l’environnement
54
ADCC
• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont reconnues par
des récepteurs des cellules NK
– La destruction est ciblée (tue les cellules ciblées)
55
Dégranulation des Mastocytes par les IgE
Granules de
médiateurs préformés
IgE
Lysosome
Récepteur de
région Fc
56
Voie Classique du Complément
C4
C2
C
C
C2a + C2b
4a
4b
Complexe C1
C5a
C3b
C3
C5
++
C3 Convertase
Convertase
C5
C5b
C3a
C1r C1q C1s
C
4bC2aC3b
C5bC6 C7 C8
CC C
C
C9
9
C9
C
C
99 99
9
•Antigène (pas nécessairement une bactérie)
57
Conséquences de la Voie Classique
• Opsonisation
– C3b & C4b
• Analphylatoxines
– C3a & C5a
• CAM
– Lyse osmotique
58
Décours de la Réponse Humorale
Reconnaissance
Mémoire
Élimination
Présentation
Activation
B naïve
Expansion
Clonale
B activé
0
7
Rencontre
avec Ag
Immunité
14
Jours après l’exposition
B mémoire
>30
59
Réponses Immunes: 1re et 2e Rencontres
Élément
Réponse primaire
Réponse secondaire
Réponse maximale
Plus faible
Plus forte
Isotype d’Ac
Habituellement
Augmentation des IgG
commence avec
(on passe directement
IgM ensuite passe à
à IgG)
IgG
Nombre d’antigène
requis
Relativement
élevée
Faible
Latence
Entre 10-21 jours
Entre 1-3 jours
60
Types d’Immunités Humorales
Naturelle
Active
Passive
Artificielle
Active
Passive
61
Immun. Acquise Naturelle Active/Passive
• Exposition naturelle à l’antigène
– En général se fait de façon naturelle
• Ex. Une infection
• Défense humorale active:
– L’individu monte ses propres défenses
– Mémoire acquise
• Défense humorale passive:
– Réponse humorale chez hôte 1
– Transfert naturel des Ac de hôte 1 à hôte 2
– Pas de mémoire acquise
• Ex. IgG transmit dans le lait maternel
62
Immun. Acquise Artificielle Active/Passive
• Exposition artificielle à l’antigène
– En général se fait avec intervention humaine
• Ex. Vaccination, transfusion
• Défense humorale active:
– L’individu monte ses propres défenses
– Mémoire acquise
• Défense humorale passive:
– Réponse humorale chez hôte 1
– Transfère artificiel des Ac à un autre hôte
• Ex. Les antivenins; générés chez les chevaux et administré à
l’homme
– Aucune mémoire acquise
63
Réponse Acquise à Médiation Cellulaire
• Pour des antigènes endogènes
– Ag fabriqués à l’intérieur de la cellule
• Ex. une cellule infectée par un virus et qui fabrique les
protéines du virus à l’intérieur
• Tout les antigènes endogènes sont présentés
sur le CMHI
• Le CMHI présente les antigènes aux
lymphocytes Tc
64
Réponse Acquise à Médiation Cellulaire
1. Choisir un lymphocyte Tc avec un RCT qui à le bon
paratope pour reconnaitre un épitope de
l’antigène associé au CMHI d’une cellule infectée
–
Sélection clonale
2. Activation du lymphocyte Tc
–
Armement par cellules TH1 préalablement activées
•
–
–
Reconnaissance par RCT approprié d’épitopes complexés au
CMHII de CPA
Amplification clonale
Tuer cellule infectée
65
Lymphocytes Tc
• Récepteur cellulaire – RCT
RCT
– Reconnaissance du non-soi présenté par
CMHI
– Un lymphocyte Tc possède un RCT capable
de reconnaître un épitope associé au CMHI
Tc
CD8
• Tc naïfs doivent être armés
– Deux signaux sont requis :
• Reconnaissance par un RCT d’un épitope spécifique
associé au CMHI
• Cytokines activatrices produites par TH1
66
Réponse à Médiation Cellulaire
• Habituellement initié par cellules
dendritiques
– Associées aux tissus connexes aux
surfaces externes
• Poumons, peau, tractus gastrointestinal, etc.
– Possède des récepteurs qui
permettent l’infection par la
majorité des virus
– Expriment CMHI( ) et CMHII( )
– Font la présentation d’antigènes
exogènes et endogènes
67
Réponse à Médiation Cellulaire
Infection
Tc
CD8
Présentation d’épitopes
endogènes sur CMHI
Présentation d’épitopes
exogènes sur CMHII
Reconnaissance par
RCT de TH1 - activation
Phagocytose
Amplification clonale de Tc armée
Reconnaissance par
RCT de Tc - armement
68
Attaque par les Cellules TC Armées
69
Survol des Réponses Immunes Acquises
Réponse humorale
Antigène
Réponse cellulaire
Phagocytose par CPA
Présentation d’épitopes
Infection cellulaire
Activation de cellule T auxiliaire
Endocytose
par cellule B
Cellule T auxiliaire activée
Cellule T cytotoxique
Plasmocytes
Cellule T cytotoxique
activée
Anticorps
Tuer
70
Interaction des Systèmes Innée et Acquis
Immunité Innée
Cellules
Barrières Chimiques
Granulocytes
Monocytes et Macrophages
Cellules NK
Anticorps
Cytokines
Cytokines
Barrières Physiques
Cytokines
Lymphocytes B
Lymphocytes T
Immunité Acquise
71