Transcript IDB HC 7 Eiwitzuivering 3

Eiwitzuivering 3
Kolom chromatografie:
- Gelfiltratie
- ionchromatografie
- affiniteitschromatografie
TBEMH-P05IDB HC7
Sigrid Beiboer en Ivo Horn
Kolom chromatografie
Verschillende soorten
Een systeem
Een systeem
Chromatogram
Een kolom
Mobiele fase
Stationaire fase
biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html
Scheiding op een kolom
Gedrag van moleculen in een kolom
adsorptie: meer
neiging tot binding
aan stationaire fase
Ideaal: verdeling lineair
CS
adsorptie
desorptie: minder
neiging tot binding
aan stationaire fase
desorptie
CM
Cs= concentratie is stationaire fase
Cm= concentratie in mobiele fase
Isothermen en piekvorm
een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft
een scherpe piek.
toenemende hoeveelheid massa
Cs
Cm
Cs
desorptie
Cm
Cs
adsorptie
Cm
piekpatroon in chromatogram
K
K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich
een molecuul in de kolom, in CS of in CM
 geeft de mate van verdeling over matrix en
mobiele fase weer
 Wet van Nernst: K = Cs/Cm

CS
K = CS/CM
CM
De “zone”; de piek
De zone is het oppervlak van de piek
 De zone is rechtevenredig met de concentratie

Kolom chromatografie
Verschillende soorten
Gelfiltratie
Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography)
Kleine moleculen hebben meer tijd nodig
De matrix voor gelfiltratie





Goede elutie eigenschappen
Hydrofiel karakter
Geen geladen groepen
Chemische resistentie
Biologische resistentie
Bijv. polymeren van:
- acrylamide (Biogel P)
- dextraan (Sephadex)
- combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl)
- agarose (Sepharose, Biogel A)
De volumina in een kolom
Vm
Vc = kolom volume
V0 = void volume (buitenvolume)
Vi = intern volume (binnenvolume)
Vm= matrix volume
Ve= elutie volume
Vc = V0 + Vi + Vm
groot eiwit: Ve=V0
klein eiwit: Ve=V0+Vi
Berekeningen met gelfiltratie

Vc = V0 + Vi + Vm = kolomvolume = π r2 h, hieruit de
benodigde hoogte

Kd of K0 = (Ve - V0) / Vi ; (Cs/CM), verdeling over kolom

K0: hoe groter de K0, hoe kleiner de molmassa (Mw):
K0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste
moleculen (volledige distributie over Vi en V0)
Toepassingen gelfiltratie
Isolatie en zuivering biomoleculen (H05PBM)
 Molecuulmassa bepaling
 Ontzouten
 Bufferverwisseling

Vraagje

Welke van onderstaande methoden kun
je gebruiken om zout te verwijderen?
Gelfiltratie
 Ultrafiltratie
 Dialyse
 Homogeniseren
 Centrifugeren

Fractieverzamelaar
• Meet OD280 en geeft dit door aan recorder
• Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en
geeft buiswisseling ook door aan recorder
Zuivering mbv gelfiltratie
Zuivering mbv gelfiltratie
Ionchromatografie
Ionenwisselaars
R-Na2 + Ca2+
Zeolieten:
R-Ca + 2Na+
- natuurlijke ionenwisselaars
- aluminiumsilicaten
Principe scheiding
Matrix en spacer arms
Matrix:
- onoplosbaar
- chemische resistent
- biologische resistent
- inert
- capaciteit
Spacer arm
vaak voor biochemische toepassingen
tegengaan sterische hindering

Matrix Spacer arm
Ligand
Biomolecuul
Ionogene groepen
• Kationenwisselaar:
- bevat negatief geladen / zure groepen
(bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100)
- uitwisseling positieve kationen
• Anionenwisselaar:
- bevat positief geladen / basische groepen
(bv. Dowex-1, DEAE)
- uitwisseling negatieve anionen
Toepassingen voor water
• Ontharding van water:
kalk, Ca2+
Na+
• Demineralisering van water:
- verwijdering kat- en anionen
- 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed)
- kationen worden vervangen door protonen
- anionen worden vervangen door OH--ionen
Op lab:
- demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom,
vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water
- mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv
Millipore kolom, soort “bidest”
Toepassingen voor eiwitten
Eiwitlading
pH hoog
pH laag
pH neutraal
Neutrale a.z.
Basische a.z.
Zure a.z.
0
0
-
0
+
0
0
n+
m-
Netto lading
-
+
n-m
Isoëlektrisch punt (IEP):
- pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is
- kan bepaald worden met isoëlektrische focussering
Hoe werkt ionchromatografie bij
eiwitzuivering?
pH boven IEP, eiwit is negatief
anionenwisselaar
pH beneden IEP, eiwit is positief
kationenwisselaar
pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom
Grotere afwijking pH van IEP
grotere affiniteit
Elutie
pH wijzigen of ionsterkte verhogen
[NaCl]=0
[NaCl]=1
M
Buffer en pH blijven gelijk
in zoutgradiënt, alleen
zoutconcentratie stijgt!
Ionchromatografie van aminozuren
Zuivering mbv ionchromatografie
Affiniteitschromatografie
Zuivering gebaseerd
op biologische functie
of individuele structuur
Scheidingsprocedure
Affiniteit
De mate van aantrekking van moleculen
reversibel, dus niet covalent!

Affiniteitschromatografie
Mobiele
fase
Stationaire
fase
Schone
uitloop
Schema affiniteitschromatografie

Matrix
Spacer arm
Ligand
Biomolecuul
Matrix
• Inert
• Open structuur
toegankelijk voor eiwitten om
aan ligand aan matrix te kunnen binden
• Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand
covalent gekoppeld kan worden
• Goede elutie eigenschappen
• Chemische stabiliteit
Voorbeelden matrix
• Agarosekorrels
• Polyacrylamide korrels
• Poreuze glazen korrels
• Grote bolvormige korrels:
geven interkorrel ruimtes, die geschikt
zijn voor AC van grote biomoleculen
zoals ribosomen, membraanfracties
en zelfs intacte cellen!
Ligand
• Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul
• Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix
mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning!
• Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces
en bestand tegen koppelingsreacties
• Bindingsaffiniteit voor biomolecuul:
- niet te sterk
- niet te zwak
- aanwezig na koppeling aan matrix
Spacer arms
• Tegen sterische hindering
• Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms
beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van
biomolecuul voor ligand
Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding
Tegengaan door klein beetje organisch
oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm

Matrix Spacer arm Ligand
Biomolecuul
Voorbeelden spacer arms
Niet selectieve elutie
Verandering van:
• pH
• Ionsterkte
Pas op voor denaturatie biomolecuul!!
AC voor IgG-antilichamen
IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G
of -L affiniteitschromatografie
Biotine
Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine
Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren
Biotine gebruikt
om het ligand aan
de matrix te
koppelen
Zuivering
biotinebindende
eiwitten
Immobilized Metal Affinity Chromatography
(IMAC)
Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten
Histidine:
• pK is 6,5
• heeft imidazole ring
IMAC
Interactie tussen twee naburige His-aminozuren
in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.
Rode staartjes = His-tag
6 histidine aminozuren
Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes.
IMAC
Zuivering van GST-fusie eiwitten
Glutathione-S-Transferase