Transcript elektroforeza

13. VAJA:
ELEKTROFOREZA
ELEKTROFOREZA
Veliko snovi v vodi ionizira. Nastanejo:
pozitivno nabite molekule – KATIONI (+),
negativno nabite molekule – ANIONI (-),
AMFOTERNE SNOVI - nosijo hkrati pozitivno in negativno nabite
skupine (+/-).
Če jih izpostavimo delovanju električnega polja, potujejo:
kationi na negativno nabito KATODO (-),
anioni na pozitivno nabito ANODO (+).
Gibanje nabitih molekul omogoča električna sila :
Fel  E  Z
Gibanju nasprotuje zavorna sila:
(trenje v raztopini, elektrostatski privlak nosilca)
Fz  v  f
ELEKTROFOREZA
Definicija:
Elektroforeza je proces ločevanja nabitih
molekul v električnem polju.
Izvedemo jo lahko:
v raztopini;
na/v nosilcu:
acetatna celuloza,
silikagel,
aluminijev oksid,
poliakrilamid,
škrob,
agaroza.
ELEKTROFORETSKA MOBILNOST
Elektroforetska
mobilnost
molekule
konstantnem električnem polju (μ) je:
pri
razmerje med hitrostjo potovanja neke molekule
(v) in električnim potencialom (E);
razmerje med nabojem na molekuli (Z) in zavornim
koeficientom (f):
v Z

E

f
Snovi, ki se razlikujejo po μ, se pri elektroforezi
premikajo kot lise, ki jih lahko zasledimo z
ustrezno analitsko metodo.
ELEKTROFORETSKA MOBILNOST
Nanjo vplivajo:
lastnosti vzorca
(velikost, naboj, oblika);
električno polje
(napetost, jakost, upornost);
pufer
(IJ ali  IJ, pH pufra);
nosilec
(adsorpcija, molekularna sita,
zamreženost).
PAGE – POLIAKRILAMIDNA
GELSKA ELEKTROFOREZA
UPORABA: predvsem za ločevanje proteinov
NOSILEC: poliakrilamidni gel
LOČEVANJE
MOLEKUL:
odvisno
od
koncentracij akrilamida in bis-akrilamida
Ob polimerizaciji nastane
“mreža”, katere gostota je
odvisna od konc. akrilamida.
Native PAGE – nativna
poliakrilamidna gelska
elektroforeza
ne prihaja do denaturacije proteinov;
manjša zamreženost gelov;
sorazmerno majhna napetost.
UPORABA:
ko želimo ohraniti biološko aktivnost ločenih molekul,
v preparatvne namene.
UPORABA:
NaDS-PAGE
določanje molekulske mase,
izvemo kaj o zgradbi proteinov (podenote),
preverjanje čistosti proteinov med posameznimi stopnjami izolacije.
1g proteina – 1,4g SDS
≈ 1 molekula SDS na
2 AK ostanka
IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE
(IEF)
Elektroforetska mobilnost je odvisna od pH.
Protein pri pH:
pod svojo izoelektrično točko potuje proti katodi (-);
pri pH nad svojo izoelektrično točko pa proti anodi
(+);
pri pH, ki je enak izoelektrični točki se protein ne
premika.
Za določanje
čistosti.
It
proteinov
in
preverjanje
BARVANJE IN DETEKCIJA
ELEKTROFORETSKIH LIS
Barvila:
Coomassie Brilliant Blue (modro obarvane lise),
srebrove soli (AgNO3) (rumeno-rjavo obarvane lise),
fluoreskamin (pod UV fluorescira),
etidijev bromid (pod UV fluorescira).
Avtoradiografija (črne lise na rentgenskem filmu)
Specifične biomolekule (encim/substrat)
Prenos proteinov na membrano
(Western blot, Immuno blot)
BARVANJE IN DETEKCIJA
ELEKTROFORETSKIH LIS
Western blot
1)
2)
3)
4)
5)
Diskontinuirana NaDS-PAGE
Vzorci:
St - standard
BSA - goveji serumski albumin
S – goveji serum
S-Ab – serum brez protiteles
Ab – izolirana protitelesa
NaDS-PAGE gel obarvan
s Coomassie Brilliant
Blue.
Diskontinuirana NaDS-PAGE
Vzorci:
St - standard
S – goveji serum
Ab – izolirana protitelesa
NaDS-PAGE gel po
srebrovem barvanju.
kDa
200,0
116,2
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
6,5
St
S
Ab
S
Ab
St
ELEKTROFOREZA
Potek dela:
Priprava 12 % ločevalnega gela
1. Zmešaj 4,35 mL bidestilirane vode, 2,5 mL Tris pufra, pH 8,8,
0,1 mL 10 % raztopine NaDS in 3 mL 40 % raztopine akrilamida.
2. Raztopino 5 minut degaziraj v ultrazvočni kopeli.
3. Dodaj 50 μL raztopine amonpersulfata in 5 μL TEMED.
4. Raztopino hitro vlij v pripravljen model za gel in jo prekrij s
plastjo destilirane vode. Počakaj 45 minut, da gel polimerizira.
ELEKTROFOREZA
Potek dela:
Priprava 4 % zbiralnega gela
1. Zmešaj 3,18 mL bidestilirane vode, 1,26 mL Tris pufra, pH 6,8,
50 μL 10 % raztopine NaDS in 0,5 mL 40 % raztopine akrilamida.
2. Raztopino 5 minut degaziraj v ultrazvočni kopeli.
3. Dodaj 25 μL 10 % APS in 5 μLTEMED.
4. S polimeriziranega ločevalnega gela odstrani vodo, namesti
glavniček, ki bo oblikoval žepke za nanos vzorca in nalij
pripravljeno raztopino na gel. Pusti, da gel polimerizira 30 minut.
Nato previdno odstrani glavniček in umesti gel v elektroforezno
celico. V zgornji in spodnji prekat nalij elektrodni pufer, tako da
prekrije gel, prekata pa ostaneta ločena.
ELEKTROFOREZA
Potek dela:
Priprava vzorca
1. Vzorce približno dvakrat razredči s pufrom za pripravo vzorca
in jih segrevaj 5 minut na 95 oC, da poteče popolna denaturacija
in redukcija proteinskih vzorcev.
2. S pipeto nanesi vzorce v pripravljene žepke. Zaradi specifične
teže glicerola bodo vzorci sedli v gel.
3. Vzporedno z vzorci pripravi standard z znanimi molskimi masami
in ga nanesi na eno ali dve mesti na gelu.
ELEKTROFOREZA
Potek dela:
Elektroforeza
1. Elektroforetsko celico pokrij in priključi na izvor napetosti. Pri
200 V in 60 mA/gel elektroforeza poteka 45 minut.
Barvanje gela
1. Po koncu elektroforeze odklopi napetost ter odpri modelčke, v
katerih si pripravil gel.
2. Zbiralni gel odreži, ločevalnega pa prenesi v raztopino za
barvanje (0,1 % raztopina barvila Coomassie Brilliant Blue R-250
v 40 % metanolu in 10 % ocetni kislini). Barvaj 30 minut.
3. Ozadje razbarvaj v raztopini 40 % metanola in 10 % ocetne
kisline (1-3 ure).
Rezultat:
V laboratorijski dnevnik nalepi sliko elektroforetskega gela in jo
komentiraj!