Transcript Replicação do DNA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA BÁSICA
BQA5109
Replicação
e
Transcrição do DNA
Florianópolis, junho de 2011
O Material Hereditário dos Cromossomos São Segmentos de DNA (genes)
 Cada célula carrega em seu núcleo as instruções para a formação de um indivíduo
completo...
DNA
NÚCLEO
CÉLULA
CROMOSSOMOS
(DNA+PROTEÍNAS)
 Possui a informação que, em
última análise, dita a função de
uma proteína;
Características celulares são
determinadas pelas proteínas que
a célula produz;
ORGANISMO
 Capacidade de autoduplicação.
Quando uma célula se divide, cada célula leva uma cópia do DNA original
DNA Possui a Informação Para Codificar Proteínas e RNAs
Cada célula carrega no seu DNA as
instruções para a formação de um
indivíduo completo
Quando a célula se divide, as células
filhas levam uma cópia dessa
informação
Origem a um novo ser com características semelhantes ao original...
DNA confere a base molecular da hereditariedade!
Relembrando: O DNA
Dupla-Hélice
Estrutura Química
Modelo Espacial
Polímero de desoxirribonucleotídeos de 4 espécies dispostos em duas fitas de sentidos
opostos (ANTIPARALELAS). A estrutura de dupla-fita é mantida por pontes fosfodiéster (que
unem nucleotídeos numa mesma fita) e ligações do tipo ponte de hidrogênio que ligam as
bases COMPLEMENTARES entre as fitas.
A Estrutura do DNA Fornece as Bases da Hereditariedade
 A cópia do material hereditário é possível graças a natureza complementar das fitas
do DNA (pareamento de bases)...
Replicação: processo de biossíntese de DNA onde, a partir de uma molécula
de DNA pré-existente formam-se duas moléculas filhas contendo uma das fitas
da molécula mãe original.
PROCESSO SEMICONSERVATIVO
A Replicação é Semi-Conservativa
Características importantes
 A replicação produz duas moléculas completas e idênticas a partir de uma molécula
de DNA original
Cada dupla-hélice filha é composta de uma fita velha (conservada) e uma fita
nova (recém-sintetizada)
Em relação a Estrutura e ao processo de Replicação do DNA é CORRETO afirmar:
(A)
O DNA é uma molécula composta por polímeros
de desoxirribonucleotídeos, dispostos em duas
fitas, sendo ambas idênticas entre si.
(B)
Em relação ao pareamento de bases do DNA,
bases púricas fazem ligação do tipo ponte de
hidrogênio com outra base púrica na fita oposta
na dupla-hélice.
(C)
Ligações do tipo fosfodiéster são responsáveis
por manter as duas fitas do DNA unidas,
auxiliando na estabilidade da molécula.
(D) A replicação do DNA é dita semi-conservativa
porque as duas novas moléculas de DNA
idênticas, são sintetizadas a partir de uma
molécula antiga.
(E)
A replicação do DNA é dita semi-conservativa
porque cada fita na dupla-hélice do DNA novo
possui uma fita nova (recém-sintetizada) e uma
fita antiga (conservada).
Replicação – Ocorre Durante a Intérfase do Ciclo Celular
Replicação do DNA  1. Iniciação
 A dupla-hélice do DNA é muito estável e proteínas auxiliam na separação das
duas fitas...
Não atuam em locais aleatórios
1- DNAa – Ligam-se a segmentos do DNA ricos
em A=T e faz com que o DNA se dissolva, as
fitas separam-se, formando regiões de DNA de
fita simples;
2 – Proteína de Ligação do DNA de Fita Simples
(SSB) – Mantém a separação das fitas e
protegem o DNA de nucleases que clivam DNA
de fita simples;
3- DNA-Helicase – Liga-se ao DNA de fita simples
e a seguir move-se na região vizinha de duplafita, forçando as fitas a se separarem,
desenrolando a dupla-hélice (requer ATP).
Os locais onde o DNA é aberto são chamados de origens de replicação e
sãoGLAST
marcados
(EAAT1) por uma seqüência particular de nucleotídeos.
GLT-1 (EAAT2)
Replicação do DNA  1. Iniciação
Replicação do DNA  1. Iniciação
 A síntese do DNA novo ocorre nas zonas ou forquilhas de replicação e é bidirecional...
Replicação do DNA  2. Alongamento da cadeia
 DNA-Polimerase – Sintetiza a nova fita usando uma das fitas velhas como molde e
catalisa a adição de nucleotídeos à fita de DNA em crescimento, verificando se foram
corretamente incorporados.
DNA-polimerase
O pareamento de bases entre o desoxirribonucleotídeo que entra e os da fita-molde
guia a formação de uma nova fita de DNA, complementar na seqüência de
nucleotídeos à fita molde.
Replicação do DNA  2. Alongamento da cadeia
DNA-polimerase catalisa a adição de
nucleotídeos à extremidade 3`-OH de uma
fita de DNA nova pela formação de uma
ligação fosfodiéster com o grupo 5`-fosfato
do nucleotídeo que está sendo incorporado
Nova cadeia é sintetizada sempre na direção
5` 3`
Os nucleotídeos entram na reação como
nucleosídeos trifosfatados de alta energia e
há quebra da ligação fosfoanidrido
A DNA-polimerase permanece associada
ao DNA e move-se ao longo da cadeia
(3’ 5’) durante a polimerização
Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase Necessita de um Primer
O mecanismo de polimerização do DNA apresenta dois problemas...
1. A DNA- polimerase
precisa de um grupo 3'-OH
para estender a cadeia de
DNA
Como se inicia a síntese de DNA?
Ribonucleotídeos
Solução: Uma enzima chamada primase sintetiza um PRIMER (10 nucleotídeos) de RNA
Ao final do processo de replicação o primer é removido
Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase
2. A enzima DNA-polimerase só sintetiza fitas novas na direção 5` 3`, fazendo a
leitura da fita molde na direção 3` 5`;
Cada fita possui uma polaridade
única (são antiparalelas)
Ambas as novas fitas parecem
crescer na mesma direção
Como é possível sintetizar as fitas novas sobre um molde que está na
direção oposta (5` 3`) ?
Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase
Não existe síntese na direção 3' 5' !!!
Solução: O problema é solucionado por uma manobra da enzima. A fita que deveria
crescer no sentido 3' 5' é feita descontinuamente, em pequenos pedaços, com a DNApolimerase trabalhando para trás a partir da forquilha de replicação.
Os fragmentos são posteriormente unidos (DNA-ligase), formando uma fita contínua.
Replicação do DNA – Fita contínua (líder) e Fita Descontínua (atrasada)
Replicação do DNA  3. Terminação
 Síntese de uma fita contínua a partir de fragmentos...
O primer de RNA é alongado pela DNA- polimerase
III até que outro RNA seja encontrado
O primer de RNA é removido pela DNA-polimerase I
(atividade 5`3` exonuclease) e a lacuna é
preenchida com desoxirribonucleotídeos pela
própria enzima (atividade 5`3` polimerase)
A quebra restante é ligada pela DNA-ligase 
catalisa a ligação fosfodiéster final entre os grupos
5’-fosfato da cadeia de DNA sintetizada pela DNApolimerase III e o grupo 3’-OH da cadeia feita pela
DNA-polimerase I.
Resumindo...
Uma maquinaria de replicação, que
envolve proteínas e enzimas,
sintetiza o novo DNA
A DNA-polimerase é a enzima responsável
pela polimerização do novo DNA
A polimerização sempre ocorre na direção
5`  3`
Um primer de RNA é utilizado na síntese da
nova fita (e posteriormente removido)
A seqüência de nucleotídeos de uma nova
fita do DNA é ditada pela fita molde
As fitas novas são sintetizadas em direções
opostas (contínua e descontínua)
Fragmentos são unidos e duas fitas
contínuas são formadas
Dogma Central da Biologia Molecular
Relembrando: O RNA
Polímero de 4 tipos de
ribonucleotídeos (4
tipos) unidos por
ligação fosfodiéster,
existente como fita
simples
RNAm
RNAr
RNAt
Características Essenciais da Transcrição
 Altamente Seletiva: de acordo com o tipo celular, para algumas regiões do DNA muitos
transcritos são feitos enquanto que, para outras, poucos transcritos são feitos.
 RNA´s podem sofrer várias modificações: Adições terminais, desbastes, remoção de
segmentos internos e junções. Estas modificações convertem o transcrito primário em uma
molécula funcional.
Transcrição – Visão Geral
Transcrição: Processo de síntese do RNA, que utiliza uma das fitas do DNA com
molde.
1 – Desenrolamento, abertura
da dupla-hélice e exposição das
bases de cada fita do DNA
2 - A seqüência de NT da fita
do RNA é determinada pela
seqüência de NT da fita molde
do DNA.
3- Os ribonucleotídeos
incorporados são
covalentemente ligados à
cadeia em formação do RNA
em uma reação catalisada por
enzima.
A cadeia nova de RNA é produzida sempre na direção 5` 3`e os ribonucleotídeos são
adicionados um por vez, de acordo com os nucleotídeos presentes na fita de DNA usada
como molde. A enzima responsável pelo processo é a RNA-POLIMERASE
Transcrição – A RNA-Polimerase
Enzima multimérica. Catalisam a formação de pontes fosfodiéster
que unem os nucleotídeos. Percorre o DNA, estendendo a fita
nova de RNA na direção 5` 3`. Utiliza nucleosídeos trifosfatos
(NTP) que, através da ruptura de suas ligações fosfoanidrídicas,
fornecem a energia que impulsiona a reação
Funções na Transcrição:
1. Reconhece sítios de iniciação (sítios promotores) no DNA;
2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hélice do DNA próximo a ela,
liberando um molde de fita única;
3. Seleciona o ribonucleosídeo fosfato correto e catalisa a formação de uma
ligação fosfodiéster; este processo é repetido muitas vezes à medida que
a enzima se move ao longo do DNA;
4. Detecta sinais de terminação;
5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da
transcrição.
Transcrição – A RNA-Polimerase
 A RNA-polimerase...
A RNA polimerase utiliza NTP
como precursores e adiciona
NMP à extremidade 3´ da
ribose da cadeia de RNA em
crescimento.
Os nucleotídeos se unem
através de uma
ligação 3´-5´fosfodiéster,
entre -OH de C3 da ribose de
um nucleotídeo e -PO4- do
nucleotídeo adjacente.
A RNA-polimerase faz uma
cópia de RNA a partir de
um molde de DNA !!!
Transcrição – A RNA-polimerase
Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO
 INICIAÇÃO: Envolve a ligação da RNA-polimerase a uma região do DNA que
determina a transcrição de um gene em particular. Esta região é conhecida como
REGIÃO PROMOTORA.
Região Promotora I = Caixa de Pribnow = Sequência TATAAT –10. Situada 10 nucleotídeos à
esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição.
Região Promotora II = Sequência - 35 = Sequência TTGACA. Situada 35 nucleotídeos à
esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição.
Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO
 A região promotora não se localiza na fita molde...
A enzima RNA-polimerase utiliza a fita 3’5’ do DNA como molde, produzindo uma fita de
RNA na direção 5’3’. A fita molde do DNA é antiparalela e complementar à fita
codificadora do DNA e ao RNA.
O RNA sintetizado possui, portanto, a mesma direção que a fita codificadora e U no lugar de T.
(DNA) Fita codificadora
5’- A T G C C A G T A G G C - 3’
(DNA) Fita molde
3’- T A C G G T C A T C C G - 5’
RNA
5’- A U G C C A G U A G G C - 3’
Etapas na Síntese de RNA – 2. ALONGAMENTO
 Alongamento: Uma vez que a região promotora tenha sido reconhecida, a RNApolimerase começa a sintetizar o transcrito e a subunidade sigma é liberada;
A RNA-polimerase desenrola a fita, expondo uma nova região de fita molde e
adiciona ribonucleotídeos à nova fita de RNA, na direção 5` 3`. A nova seqüência
de nucleotídeos é determinada pela fita molde do DNA
Etapas na Síntese de RNA – 3. TERMINAÇÃO
 Terminação: O alongamento continua até um sinal de terminação ser atingido...
No final, RNA-polimerase e o transcrito são liberados...
OBS: Em alguns casos, uma proteína adicional (fator rô) pode ser requerida para a
liberação do transcrito.
Transcrição em Eucariotos
 Transcrição em Eucariotos: Mais complexa que em Procariotos e algumas etapas
ainda não são bem compreendidas.
 Além do reconhecimento de uma região promotora (CAAT e TATA Box), diversos
fatores de transcrição complementares ligam-se a sítios no DNA, regulando o
processo.
Modificação Pós-Transcricional do RNA = identidade do RNA
 Após a formação do transcrito primário, os RNA´s são modificados e este transcrito
inativo transforma-se em uma molécula funcional.
RNA Ribossômico
Modificação Pós-Transcricional do RNA
RNA Transportador
Nucleotidil-transferase
Modificação Pós-Transcricional do RNA
RNA Mensageiro
Geralmente idêntico ao transcrito primário em procariotos, mas é
muito modificado nos eucariotos.
 Adição de CAP 5` e de uma Cauda poli-A:
Facilita a iniciação da tradução e auxilia a estabilizar a molécula
Poli-A-polimerase
guanidil transferase
Guanina-7-metil-transferase
Auxilia na estabilização do RNAm e facilita sua saída do núcleo.
Modificação Pós-Transcricional do RNA
RNA Mensageiro
 Remoção de Íntrons: A funcionalidade do RNAm eucariótico pode envolver a remoção
de seqüências de RNA (íntrons) que não codificam proteínas. As seqüências restantes
(exons) são unidas para formar o RNA maduro.
Catalisado por enzimas snRNPs
(pequenas partículas de ribonucleoproteína
nuclear) que são formadas por Proteína + RNA
Permite que muitos genes possam ser processados,
produzindo RNAm diferentes, dependendo do tipo
da célula no qual o gene está sendo expresso ou o
estágio de desenvolvimento
1 gene ≠proteínas
Resumo...