Transcript pKGTM: 基于lentivirus的一步法诱导性shRNA表达系统

pKGTM: 基于lentivirus的
一步法诱导性shRNA表达系统
Presented by BioEverest Technologies
2009
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pKGTM一步法诱导性shRNA表达系统的构建
(patent pending)
pKGTM lentiviral 载体示意图
2
pKGTM与其它基于RNAi的knockdown技术的比较
转入方式
效率
可诱导性
稳定细胞株
建立稳定株步数
挑选单克隆
体内应用
siRNA
持续性表达
lentiviral shRNA
其它诱导性表达
lentiviral shRNA
pKG™ One-step
诱导性表达
lentiviral shRNA
转染
低
否
否
N/A
N/A
否
感染
高
否
不一定
1
可能需要
不一定
感染
高
是
是
2
需要
是
感染
高
是
是
1
不需要
是
3
pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(一)
- 建立可诱导性表达shRNA的稳定细胞株 高滴度pKGTM诱导性shRNA表达的lentiviral particles
(
BioEverest提供)
一步感染目标细胞株
(1天)
筛选可诱导性表达shRNA稳定的细胞株
(puromycin 3-5天, 无需挑选克隆)
扩增, 建立可诱导性表达shRNA稳定的细胞株
(1-7天, 视细胞生长速度)
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pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(二)
- 体内和体外Dox诱导shRNA引起的knockdown效果体 外
体 内
图： pKG™一步可诱导性shRNA系统建立的稳定HCT116细胞中，在体外和体内（皮下异体移植）沉默癌基因PIK3CA。
(A) pKG™一步可诱导性shRNA系统表达的慢病毒，在稳定的HCT116细胞中用Dox (100ng/ml, 72 h) 诱导沉默癌基因
PIK3CA/p110alpha (Western Blot)；
(B) 稳定诱导的HCT116细胞被皮下植入裸鼠体内后用含DOX饮水喂养（详情可查阅）。由WB对沉默基因的PIK3CA的
表达和下游的磷酸化标记物（p473-AKT）作出评估。TetR表达作为上样量控制。用三组小鼠（+ / - DOX）进行了测
试．
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pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(三)
- 体内和体外Dox诱导shRNA引起的phenotypes 体 外
体 内
图：使用pKG诱导性shRNA表达系统沉默癌基因KRAS后，出现的在体外和体内的HCT116结肠癌细胞的生长抑制。
（A）用pKG™-可诱导性KRAS shRNA转导的慢病毒而建立的稳定HCT116细胞做克隆形成试验，沉默癌基因KRAS
(Dox 100ng/ml, 10 days) 导致肿瘤细胞体外生长抑制.
（B）相同的细胞系被植入小鼠（皮下）, 植入10天后，肿瘤的大小约100 mm3. 然后小鼠被喂食含DOX的饮用水。肿
瘤的大小每5天测量一次。观察到体内肿瘤生长抑制。
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一步法诱导性shRNA表达系统的构建
(patent pending)
bio
无Dox: tetR结合, 抑制shRNA表达(无泄露)
有Dox: tetR脱离, shRNA表达(去除可重新抑制)
5’ LTR
U6
TRE
Pol III shRNA 启动子
Dox 诱导性 tetR
结合反应元件
shRNA codon
pTK
编码 shRNA
的DNA序列
TK启动子
绝缘区
tetR
编码tetR序列
IRES
Puro (Neo or GFP)
3’ LTR
编码选择标志物序列
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No Dox: TetR bounds to TRE that suppresses shRNA expression (minimal leakage)
With Dox: TetR releases from TRE that triggers shRNA expression (reversible)
5’ LTR
U6
TRE
Pol III sh/miRNA promoter
shRNA codon
pTK
shRNA seq
TK promoter
Tet-responsive element
Insulator seq
tetR
TetR cDNA
IRES
Neo
Selective Marker in
Mammalian cells
3’ LTR