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BIOLOGIA MOLECOLARE PER CORSO DI LAUREA
IN MEDICINA, Io ANNO
TESTO CONSIGLIATO: Strachan e Read (UTET)
Genetica umana molecolare
Docenti:
Prof.ssaValeria Poli
Prof. Ferdinando Di Cunto
[email protected]
[email protected]
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
Sezione di Biologia
Via Santena 5 bis (II piano)
CALENDARIO LEZIONI (FINO A PASQUA)
CANALE A:
CANALE B:
Marzo:
Lu 24
Lu 31
Marzo:
Mar 25
Aprile:
Aprile:
Mar 1
Gio 3 (ore 8:30)
Lu 7
Mer 9
Mar 15
Mer 16 (ore 14-16)
Mer 2
Mar 8
Gio 10
Lu 14
Mer 16
LUCIDI
ESAMI
- Introduzione: la biologia molecolare e le sue implicazioni in Medicina
- La tecnologia del DNA ricombinante:

Concetto di clonaggio e di genoteca

Enzimi di restrizione

Vettori plasmidici, virali e altro

Sistemi per evidenziare gli acidi nucleici da campione biologico: Southern blot, Northern blot, PCR

La PCR in diagnostica e per identificazione individuale e di relazioni di parentela
(NB: Strachan, capitoli 4,5,6, 17.4)
- L’organizzazione del genoma umano e la sua evoluzione

L’organizzazione dei geni umani

pseudgeni e frammento genici

sequenze non codificanti

sequenze ripetute ed elementi trasponibili
(NB: Strachan, capitolo 7 + appunti)
- Concetti e implicazioni del controllo dell’espressione genica:

Schema riassuntivo del controllo trascrizionale di un gene eucariota.

La cromatina nella regolazione della trascrizione (metilazione, acetilazione)

Gli attivatori e i repressori trascrizionali: cosa sono, come agiscono

meccanismi di imprinting

Interferenze con l’espressione genica nelle patologie umane

Gli inibitori delle acetil transferasi degli istoni nella terapia dei tumori
(NB: Strachan, capitolo 8 + appunti)
-Organismi transgenici e medicina
animali transgenici (Strachan, capitolo 21 + appunti)
•OGM in agricoltura e zootecnia (appunti)
I progetti genoma e la loro importanza per la medicina

Il progetto genoma umano

Importanza dei progetti genoma degli organismi modello per la comprensione del genoma umano

Era pre- e post-genomica
(NB: Strachan, capitolo 13 + appunti)
- L’identificazione dei geni patologici nell’uomo, patologia molecolare.

Clonaggio posizionale

Clonaggio funzionale

Approccio del gene candidato

Conferma del gene candidato

Classi di mutazioni possibili
(NB: Strachan, capitolo 15 e 21 + appunti)
- Banche di dati genetici e genomici
(NB: Strachan, XIX-XXIII + appunti)
- Terapia genica

Terapia cellulare e terapia genica

Strategie terapeutiche

Vettori virali e non virali

Problemi etici
(NB: Strachan, capitolo 22 + appunti)
Clonazione degli organismi eucarioti e possibili applicazioni
Clonazione di animali: come e perché?
•La clonazione umana: perche’?
•Prospettiva: combinazione della clonazione terapeutica con la terapia genica
(NB: Strachan, capitolo 21 + appunti)
SITI WEB UTILI
• http://www.bios.co.uk: sito dell’editore, illustrazioni e esercizi (?)
• http://www.whfreeman.com/biology/: lista di siti libri e link su internet
• http://www.whfreeman.com/lodish/index.htm:
estratto dal Lodish-Molecular Cell Biology
• Esercizi interattivi
• Esperimenti classici
• Animazioni
• Siti web correlati
• http://www.biointeractive.org/: laboratorio virtuale
• http://www.biology.arizona.edu/molecular_bio/molecular_bio.html: set
di test interattivi e lezioni illustrative
• http://www.zoo.utoronto.ca/able/hotsites/hotsites.htm: lista di siti
“caldi”
BIOLOGIA MOLECOLARE
• Scienza che studia le molecole “della vita” (macromolecole) con lo
scopo di integrarle nei fenomeni biologici
oppure
• Scienza che studia le macromolecole e come queste interagiscono per
dare origine a fenomeni biologici
• Base fondamentale per la tecnologia del DNA ricombinante e
l’ingegneria genetica
• La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano le
interazioni tra macromolecole e il loro significato biologico passa
attraverso la caratterizzazione della loro struttura primaria (sequenza).
• La conoscenza della sequenza del DNA genomico, sia codificante che
non, ci permette la catterizzazione della struttura dei geni e della
struttura primaria delle proteine o degli RNA da loro codificati.
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
La tecnologia del DNA ricombinante
• Clonaggio del DNA (DNA ricombinante)
• Endonucleasi di restrizione
• Ibridazione di acidi nucleici
• Sequenziamento del DNA
• Reazione polimerasica a catena (PCR)
DEFINIZIONI
• Complementarieta’: una sequenza nucleotidica S e’ la complementare di S’
se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick
• Ibridizzazione: l’appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari
• Tm (temperatura di fusione): temperatura alla quale il 50% di una certa
sequenza nucleotidica e’ ibridizzata al suo filamento complementare.
• Sonda: molecola di DNA o RNA a singolo filamento con una sequenza
specifica, marcata e utilizzata per visualizzare la presenza della sua
complementare tramite ibridizzazione.
• Oligonucleotide:breve filamento di acido nucleico, che puo’ essere sintetico
• DNA polimerasi: gruppo di enzimi che possono copiare una sequenza di
•
DNA sintetizzando il filamento omologo. Necessitano di un oligonucletide di
innesco (primer) appaiato al filamento stampo
DNA ligasi: catalizza la formazione di legame fosfodiesterico tra 2 molecole
di DNA con estremità compatibili
• Trascrittasi inversa: enzima che e’ in grado di copiare una molecola di RNA
in una di DNA complementare
• cDNA: copia in DNA dell’RNA messaggero
Il clonaggio del DNA
• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’
isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA
capace di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema
cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la
medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata,
permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
-Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il
DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica.
-Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il
SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.
-Le metiltransferasi metilano le basi del DNA appena sintetizzato
-Sistemi di Restrizione e modificazione sono stati scoperti in molti
batteri
-In genere vengono metilati: C5 di anello citosina
N4 di anello citosina
N6 di anello adenina
COSA SERVE AL BATTERIO IL SISTEMA DI RESTRIZIONEMODIFICAZIONE?
A evitare infezioni da parte di fagi (se il loro DNA non è metilato
nei punti giusti verrà tagliato)
-Molti fagi hanno sviluppato un sistema di anti-restrizione
TIPO II: Costituite da due subunità 1-metila il DNA
2-taglia
FUNZIONANO ANCHE SEPARATE!
RICONOSCONO SEQ PALINDROMICHE
TAGLIANO ALL’INTERNO DI SEQ
RICONOSCIUTE O A DISTANZA DEFINITA.
UTILIZZATE PER MAPPARE E CLONARE IL
DNA.
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche
(sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi).
EcoRI
BamHI
E =
co =
R =
I =
genere Escherichia
specie coli
ceppo RY13
prima endonucleasi isolata
G/AATTC
CTTAA/G
B = genere Bacillus
am = specie amyloliquefaciens G/GATCC
H = ceppo H
CCTAG/G
I = prima endonucleasi isolata
TIPO DI TAGLIO:
-BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO
Es. SmaI
5’-CCC GGG-3’
5’-CCC-3’
5’- GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
3’-GGG-5’
3’-CCC-5’
-STICKY ENDS O CODINE ADESIVE:
-5’ PROTRUDING
-3’ PROTRUDING
Es. Eco RI (5’ PROTRUDING)
5’-G/AATTC-3’
5’-G-3’
5’-AATTC-3’
3’-CTTAA/G-5’
3’-CTTAA-5’
3’-G-5’
Es. Kpn I (3’ PROTRUDING)
5’-GGTAC/C-3’
5’-GGTAC -3’
5’-C-3’
3’-C/CATGG-5’
3’-C-5’
3’-CATGG-5’
QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE?
La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi se
assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole
di DNA:
-per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA
un taglio ogni 256 nucleotidi (4x4x4x4).
-per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN
MEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (46).
Frammenti con estremita’ coesive complementari
possono essere facilmente legati covalentemente
EcoRI
TaqI
HindIII
Le estremita’ coesive compatibili si appaiano,
ei
gruppi 3’-idrossilico e 5’-fosfato di 2
frammenti
appaiati si trovano cosi’ ad essere adiacenti
La DNA ligasi (derivata dal batteriofago T4)
catalizza la formazione di un legame
fosfodiestere
tra i gruppi 3’-idrossilico e 5’-fosfato
Clonaggio: vettori plasmidici
I plasmidi sono molecole di DNA
extra-cromosomali che si auto-replicano
Sono presenti in natura in batteri, lieviti
e alcuni eucarioti superiori, in uno stato
di relazione parassitica o simbiontica
verso la cellula ospite
Molti plasmidi contengono caratteri (geni)
che arrecano beneficio alla cellula ospite (es.
resistenza a un antibiotico)
Molti plasmidi sono in grado di
auto-trasferirsi da una cellula all’altra.
Clonaggio in vettore plasmidico
generato tramite restrizione
DNA ligasi
Limiti del clonaggio in vettori plasmidici
• Bassa efficienza di trasformazione e bassa densita’a cui si possono
crescere le colonie
• limitata capacita’ di contenuto
**************
• uso di vettori derivati dal batteriofago l, particolarmente per l’analisi
di librerie genomiche o di cDNA
Il batteriofago l
Vettori che possono contenere inserti più lunghi di
40 kb
• BAC (bacterial artificial chromosome)
>300 kb
• PAC (basato sul fago P1)
85-100 kb
• YAC (yeast artificial chromosome)
fino a 2 Mb
Le genoteche o librerie di DNA:
–Libreria genomica: collezione di cloni che
include tutto il DNA genomico di una certa specie
(es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109
coppie di basi, che possono essere contenute in
circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno)
–Libreria di cDNA: collezione di cloni che
include tutte le specie di mRNA (trascritte in
cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle
piu’ rare
Costruzione di una libreria genomica
Costruzione di librerie genomiche utilizzando il fago
l come vettore
Costruzione di una libreria di cDNA
Analisi dei cloni ottenuti
• Crescita dei cloni, purificazione del
DNA plasmidico e analisi con
enzimi di restrizione
• Sequenziamento
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
Visualizzazione dei frammenti separati per
elettroforesi
MAPPE DI RESTRIZIONE
Mappare multipli siti di restrizione